[发明专利]一种利用分子标记鉴别黑唇苜蓿盲蝽种群的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子标记检测技术领域，特别是涉及利用分子标记鉴别黑唇苜蓿盲蝽种群的方法，以及鉴别黑唇苜蓿盲蝽种群的特异性引物组合。

背景技术

黑唇苜蓿盲蝽(Adelphocoris ngritylus)属于半翅目(Hemiptera)盲蝽科(Miridae)苜蓿盲蝽属(Adelphocoris)，为一种棉田害虫，植食性，成虫常见于葎草、马铃薯、十字花科等寄主植物上，分布范围较广，北至黑龙江，南至贵州等地均有其分布。在调查过程中，申请人发现在中国的东北地区，例如辽宁、黑龙江等地；华北的河南、河北、山东、北京等地该种的种群数量较大；宁夏、贵州等地虽有该种的分布但种群数量相对较少。虽有相关研究显示该种体色变异较大，淡色个体近黄褐色，深色个体近黑色，南方个体一般色深，但是仅通过外部形态特征鉴别不同地区种群个体，即使是专业的技术人员在鉴别的过程中也会存在一定的主观性且很难准确的进行鉴别。快速有效地对黑唇苜蓿盲蝽东北和华北地区种群进行鉴别，可以针对不同种群合理用药，从而有效地减少黑唇苜蓿盲蝽对作物的危害。遗传分析结果显示：东北地区种群遗传多样性低于华北地区种群，因此在对不同地区种群进行药剂防治的过程中，人们可以有选择性的选择不同的药剂类型，用量，以节约药剂成本，避免浪费，减少农业污染。因此现有技术迫切需要建立一个快速、准确有效鉴别黑唇苜蓿盲蝽种群的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鉴别黑唇苜蓿盲蝽种群的特异性引物组合，本发明的另一目的在于提供一种利用分子标记鉴别黑唇苜蓿盲蝽种群的方法，特别是对东北种群和华北地区种群进行鉴别。

本发明中使用的两种线粒体分子标记严格遵守母系遗传，进化速率快，在短时间内即能完成谱系间遗传分化，能够快速实现对黑唇苜蓿盲蝽东北地区和华北地区种群鉴别的目的，是一种非常可靠的分子生物学方法。

本发明首先提供了用于鉴定黑唇苜蓿盲蝽(Adelphocoris ngritylus)种群的特异性引物组合，所述特异性引物组合包括两个特异性引物对，分别以黑唇苜蓿盲蝽线粒体细胞色素氧化酶I基因和线粒体NADH脱氢酶亚基4基因为靶序列，特异性引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-2和SEQ ID NO.3-4所示。

①Ngri-COI-F：

5'–ATGAATAAATGATTATTTTCCACAAATCA–3'(SEQ ID NO.1)

Ngri-COI-R：

5'–CTGAATAATTAATATTTGTGCCATGAATG–3'(SEQ ID NO.2)

②Ngri-ND4-F：

5'–AAAATACCATTAAAGTAAACAAATCAATTT–3'(SEQ ID NO.3)

Ngri-ND4-R：

5'–ATATATTATTTATTTTTTGAGTGTAGTTTAATCCCT–3'(SEQ ID

NO.4)

本发明提供了上述特异性引物组合在制备鉴定黑唇苜蓿盲蝽(Adelphocoris ngritylus)种群试剂盒中的用途。

所述的种群为东北种群和华北种群。

一种含有上述特异性引物组合的鉴定黑唇苜蓿盲蝽(Adelphocorisngritylus)种群的试剂盒属于本发明的保护范围。

本发明的试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液、标准阳性模板中的至少一种。

进一步地，本发明提供一种利用分子标记鉴别黑唇苜蓿盲蝽(Adelphocoris ngritylus)种群的方法，包括以下步骤：

(1)提取黑唇苜蓿盲蝽基因组DNA；

(2)以步骤(1)中提取的DNA样品为模板，利用本发明所述的特异性引物组合分别进行PCR扩增反应；所述特异性引物组合中的特异性引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-2和SEQ ID NO.3-4所示；

(3)两次PCR产物纯化，测序，串联，分析。

本发明的方法中，25μL的PCR反应体系为：2×Taq PCR Master Mix反应缓冲液12.5μL，10μM上、下游引物各1μL，DNA模板2μL，无菌水补足至25μL。

本发明的方法中，PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，退火温度下退火1min，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min；