[发明专利]一种基于OCTS技术的恶性胶质瘤CAR-T治疗载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种基于OCTS技术的恶性胶质瘤CAR-T治疗载体，其特征在于，包括慢病毒骨架质粒、人EF1α启动子、OCTS嵌合受体结构域和PDL1单链抗体；

所述慢病毒骨架质粒包括：用于目的菌株大量扩增的含氨苄青霉素抗性基因AmpR序列，如SEQ ID NO.1所示；用于质粒复制的原核复制子pUC Ori序列，如SEQ ID NO.2所示；用于增强真核细胞内的复制的病毒复制子SV40 Ori序列，如SEQ ID NO.3所示；用于慢病毒包装的慢病毒包装顺式元件；ZsGreen1绿色荧光蛋白，如SEQ ID NO.11所示；IRES核糖体结合序列，如SEQ ID NO.12所示；用于增强转基因的表达效率的eWPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件，如SEQ ID NO.13所示；

所述人EF1α启动子的序列如SEQ ID NO.14所示；

所述OCTS嵌合受体结构域包括：如SEQ ID NO.15所示的CD8 leader嵌合受体信号肽、如SEQ ID NO.16所示的PDL1单链抗体轻链VL、如SEQ ID NO.17所示的PDL1单链抗体重链VH、如SEQ ID NO.18所示的EGFRvIII单链抗体轻链VL、如SEQ ID NO.19所示的EGFRvIII单链抗体重链VH、如SEQ ID NO.20所示的抗体内铰链Inner-Linker、如SEQ ID NO.21所示的单链抗体间铰链Inter-Linker、如SEQ ID NO.22所示的CD8 Hinge嵌合受体铰链、如SEQ IDNO.23所示的CD8 Transmembrane嵌合受体跨膜区、如SEQ ID NO.26所示的TCR嵌合受体T细胞激活域以及嵌合受体共刺激因子区域；所述嵌合受体共刺激因子区域采用如SEQ IDNO.24所示的CD28嵌合受体共刺激因子以及如SEQ ID NO.25所示的CD134嵌合受体共刺激因子组合。

2.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述慢病毒包装顺式元件采用第二代慢病毒载体或第三代慢病毒载体；所述第二代慢病毒载体包括：如SEQ ID NO.5所示的慢病毒5terminal LTR、如SEQ ID NO.6所示的慢病毒3 terminal Self-Inactivating LTR、如SEQID NO.7所示的Gag顺式元件、如SEQ ID NO.8所示的RRE顺式元件、如SEQ ID NO.9所示的env顺式元件、如SEQ ID NO.10所示的cPPT顺式元件；所述第三代慢病毒载体包括：如SEQID NO.5所示的慢病毒5 terminal LTR、如SEQ ID NO.6所示的慢病毒3 terminal Self-Inactivating LTR、如SEQ ID NO.7所示的Gag顺式元件、如SEQ ID NO.8所示的RRE顺式元件、如SEQ ID NO.9所示的env顺式元件、如SEQ ID NO.10所示的cPPT顺式元件，以及如SEQID NO.4所示的RSV启动子。

3.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述如SEQ ID NO.16所示的PDL1单链抗体轻链VL、如SEQ ID NO.17所示的PDL1单链抗体重链VH、如SEQ ID NO.18所示的EGFRvIII单链抗体轻链VL、如SEQ ID NO.19所示的EGFRvIII单链抗体重链VH、如SEQ ID NO.20所示的抗体内铰链Inner-Linker、如SEQ ID NO.21所示的单链抗体间铰链Inter-Linker采用串联连接方式或者转角连接方式；所述串联连接方式具体为：PDL1单链抗体轻链VL与EGFRvIII单链抗体轻链VL采用单链抗体间铰链Inter-Linker连接，PDL1单链抗体轻链VL与PDL1单链抗体重链VH采用抗体内铰链Inner-Linker连接，EGFRvIII单链抗体轻链VL与EGFRvIII单链抗体重链VH采用抗体内铰链Inner-Linker连接；所述转角连接方式具体为：EGFRvIII单链抗体轻链VL与EGFRvIII单链抗体重链VH采用抗体内铰链Inner-Linker连接，PDL1单链抗体轻链VL与EGFRvIII单链抗体重链VH采用单链抗体间铰链Inter-Linker连接，PDL1单链抗体重链VH与EGFRvIII单链抗体轻链VL采用单链抗体间铰链Inter-Linker连接。