[发明专利]一种基于OCTS技术的恶性胶质瘤CAR-T治疗载体及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种基于OCTS技术的恶性胶质瘤CAR‑T治疗载体，包括慢病毒骨架质粒、人EF1α启动子(SEQ ID NO.14)、OCTS嵌合受体结构域和PDL1单链抗体；OCTS嵌合受体结构域包括：CD8 leader嵌合受体信号肽(SEQ ID NO.15)、PDL1单链抗体轻链VL(SEQ ID NO.16)、PDL1单链抗体重链VH(SEQ ID NO.17)、EGFRvIII单链抗体轻链VL(SEQ ID NO.18)、EGFRvIII单链抗体重链VH(SEQ ID NO.19)、抗体内铰链Inner‑Linker(SEQ ID NO.20)、单链抗体间铰链Inter‑Linker(SEQ ID NO.21)、CD8 Hinge嵌合受体铰链(SEQ ID NO.22)、CD8 Transmembrane嵌合受体跨膜区(SEQ ID NO.23)、TCR嵌合受体T细胞激活域(SEQ ID NO.26)以及嵌合受体共刺激因子区域。此外，本发明还公开了该载体的构建方法及其在制备治疗恶性胶质瘤的药物中的应用。

技术领域

本发明属于医学生物领域，具体涉及一种载体，尤其涉及一种基于OCTS技术的恶性胶质瘤CAR-T治疗载体。此外，本发明还涉及该载体的构建方法和应用。

背景技术

肿瘤免疫治疗的理论基础是免疫系统具有识别肿瘤相关抗原、调控机体攻击肿瘤细胞(高度特异性的细胞溶解)的能力。1950年代，Burnet和Thomas提出了“免疫监视”理论，认为机体中经常会出现的突变的肿瘤细胞可被免疫系统所识别而清除，为肿瘤免疫治疗奠定了理论基础[Burnet FM.Immunological aspects of malignant disease.Lancet,1967；1:1171-4]。随后，各种肿瘤免疫疗法包括细胞因子疗法、单克隆抗体疗法、过继免疫疗法、疫苗疗法等相继应用于临床。

2013年一种更先进的肿瘤免疫疗法---CAR-T疗法成功用于临床，并表现了前所未有的临床疗效。CAR-T，全称是Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。该疗法是通过转基因的手段，将启动子、抗原识别区、共刺激因子、效应区等共同组成的嵌合分子，导入T细胞基因组内，从而使T细胞对靶细胞的识别、信号转导、杀伤等功能融为一体，实现了对靶细胞的特异性杀伤[Eleanor J.Cheadle,etal.CAR T cells:driving the road from the laboratory to theclinic.Immunological Reviews 2014.Vol.257:91–106]。CAR-T疗法在临床上最领先的有诺华的CLT019，采用CLT019治疗复发难治急性淋巴细胞白血病患者，六个月的肿瘤无进展生存率达到67％，其中最长的应答时间达到两年多。总部位于中国上海的上海优卡迪生物医药科技有限公司与医院合作，截止到2017年2月，共治疗复发难治急性淋巴细胞白血病患者36例，其中完全24例，缓解比例达到66.6％。这是抗癌研究的颠覆性突破。CAR-T细胞疗法可能是最有可能治愈癌症的手段之一，并被《Science》杂志评为2013年度十大科技突破之首。

CAR-T目前在治疗B-淋巴细胞白血病等几种类型的血液肿瘤方面疗效显著，但是也存在一些局限性，目前一个嵌合抗原受体只能识别一种抗原靶标，肿瘤细胞是个复杂的群体，含有相应抗原的肿瘤细胞被清除以后，不含相应抗原的肿瘤细胞会迅速增殖，一段时间后导致肿瘤复发。那么要使CAR-T识别能同时识别两种抗原，就有两个方案可选：一是将两组嵌合抗原受体构建进入一个慢病毒转基因载体，一次性将两组嵌合抗原受体转导进入原代T淋巴细胞；二是用两个慢病毒转基因载体分两次转导，将两组嵌合抗原受体分别转导进入原代T淋巴细胞。

方案一的缺点在于占用慢病毒转基因载体的宝贵容量，不利于装载其它功能元件；转基因载体包装效率低；基因转导效率非常低，很难转导进入原代T淋巴细胞内。

方案二的缺点在于需要经过两次转导，两次转导的综合效率较低，转导周期时间长，原代细胞容易衰老，导致增殖能力衰退，杀伤功能下降，影响肿瘤清除疗效。