[发明专利]一种基于CRISPR/Cas9技术的Glrx1基因敲除动物模型的构建方法

权利要求书

1.一种基于CRISPR/Cas9技术的Glrx1基因敲除动物模型的构建方法，其特征在于包含以下步骤：

步骤一：靶向小鼠Glrx1基因的sgRNA的选择和设计

在Glrx1内含子相应位置设计相应的sgRNA，所述sgRNA引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示；

步骤二：sgRNA载体构建

首先BsaI酶切pUC57-sgRNA载体，37℃水浴1h后，1%的琼脂糖电泳，回收酶切产物；然后将步骤一中所述的sgRNA引物进行退火；最后，连接退火产物与回收的酶切产物，转化大肠杆菌，挑选单克隆进行PCR、PCR结果呈阳性送测序验证，得到正确的sgRNA载体；

步骤三：采用转录试剂盒，体外转录sgRNA和Cas9 mRNA，转录好的sgRNA备用；其中，Cas9表达质粒为Addgene plasmid # 42335；

步骤四：Cas9 mRNA和sgRNA 组成的Cas9 sgRNA体系的小鼠受精卵显微注射，其中，Cas9表达质粒为Addgene plasmid # 42335；

步骤五：F0代小鼠出生与鉴定；

步骤六：F0小鼠性成熟配繁，F1代小鼠鉴定。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于步骤六：F0代小鼠在性成熟后和C57BL/6J小鼠回交进行配繁，出生F1代小鼠在1周龄进行剪尾鉴定，得到阳性的F1代杂合子。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于从mRNA水平和酶解测序来鉴定F1代小鼠。

4.一种基于 CRISPR-Cas9 基因敲除技术的Glrx1基因敲除试剂盒，其特征在于包括 ：

1) sgRNA载体，所述的sgRNA载体以pUC57-sgRNA载体为出发载体，含针对Glrx1基因的sgRNA；该sgRNA由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的sgRNA引物退火得到；

2)以及配套的检测试剂，用于检测 Glrx1基因的剪切效果和评估基因敲除效率。

5.根据权利要求4所述的基于 CRISPR-Cas9 基因敲除技术的Glrx1基因敲除试剂盒，其特征在于还包含Cas9 mRNA或用于表达Cas9 mRNA的Cas9表达质粒。