[发明专利]一种基于CRISPR/Cas9技术的Glrx1基因敲除动物模型的构建方法

说明书

本发明公开了一种基于CRISPR/Cas9技术的Glrx1基因敲除动物模型的构建方法。包括以下步骤：一、靶向小鼠Glrx1基因的gRNA的选择和设计。二、sgRNA载体构建。三、sgRNA体外转录。四、小鼠一细胞期受精卵注射。五、F0代小鼠出生和鉴定。六、阳性F0代小鼠配繁，F1代小鼠出生与鉴定。通过本发明方法，能够成功获得Glrx1基因敲除动物模型。

技术领域

本发明属于利用基因修饰技术制作基因敲除动物模型的领域，具体涉及一种基于CRISPR/Cas9技术的Glrx1基因敲除动物模型的构建方法。

背景技术

CRISPR/Cas(Clustered Regularly Interspaced Shot Palindromic repeats/CRISPR-associated)系统，是一种来源于细菌获得性免疫的由RNA介导Cas蛋白对目的基因进行靶向修饰的技术。经过研究者改造过的Type II CRISPR/Cas9系统自2013年成功敲除哺乳动物细胞后，现在己经被应用于多种模式生物的基因敲除。CRISPR/Cas9系统载体构建简单快速、易操作、省时省力周期短，且几乎对所有物种都适用。CRISPR/Cas9和TALEN(Transcription Activator-like Effector Nucleases)的作用都是实现染色体上特定位点的双链断裂，然后引发自主损伤修复，修复会引发插入或缺失，从而造成基因序列永久的缺失，即基因敲除。针对每个基因，CRISPR/Cas9只需要构建一个sgRNA(single guideRNA)，而且效率都很高，序列选择限制较小，只需要基因组上出现GG就可以。与zinc-fingernucleases(ZFNs)and TALEN相比，CRISPR/Cas9系统具有相同或者更高的基因编辑效率，更便宜。相对于TALEN，CRISPR/Cas9引起的脱靶效应较高，但是使用成对sgRNA/Cas9-D10A>截短的sgRNA或者FoKI-dCas9可以极大的降低脱靶效应。目前，CRISPR/Cas9主要应用于基因定点突变(插入或缺失)、基因定点敲入、两位点同时突变、小片段的缺失、编码基因和非编码基因(lncRNA、microRNA)的靶向基因敲除。

谷氧还蛋白(glutaredoxin,Glrx)普遍存在于细菌、病毒和哺乳动物体内，其表达受干扰素(interferon，IFN)调控，分子量为12kDa，由106-107个氨基酸残基组成，是硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)家族的重要分支，作为电子供体，参与组成巯基-二硫键氧化还原酶家族，依靠谷胱甘肽(GSH)将氧化状态的蛋白质二硫键还原为巯基，以维持细胞氧化还原稳态，在细胞信号转导过程中发挥重要作用。有文献报道，在氧化应激引起的损伤中，蛋白质氧化损伤先于核酸，蛋白发生羰基化和糖基化，从而失去生物活性。大量研究表明Glrx1是一种具有多种生物学功能的多效性细胞因子，与调节氧化还原反应、细胞生长和抑制凋亡有密切关系，与人类某些疾病，如获得性免疫缺陷综合征和细菌感染等的发生、发展也相关。

谷氧还蛋白是机体内能特异、高效的还原谷胱甘肽化蛋白质的一种酶蛋白，Glrx特异的恢复氧化应激损伤产生的谷胱甘肽化蛋白活性的能力可能会使其成为热点药物。构建Glrx1基因敲除小鼠模型，对于研究氧化应激、营养健康等具有重要意义。但传统的基因敲除方法成功率极低，一直未得到应用。近年来，CRISPR/Cas9技术得到广泛应用，为Glrx1基因敲除模型鼠的构建及其在营养与健康研究中的应用提供了可能性。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于CRISPR/Cas9技术的Glrx1基因敲除动物模型的构建方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现。

一种基于CRISPR/Cas9技术的Glrx1基因敲除动物模型的构建方法，包含以下步骤：

步骤一：靶向小鼠Glrx1基因的gRNA的选择和设计