[发明专利]通过合成生物学手段异源生物合成灵芝酸的方法

权利要求书

1.一种通过合成生物学手段异源生物合成灵芝酸的方法，其特征在于，首先依据筛选原则从灵芝基因组中选择可能参与灵芝酸生物合成的CYP基因，然后分别将其克隆到酵母表达质粒，并将酵母表达质粒分别转化至重组微生物酿酒酵母中进行异源表达，通过对转化后的菌株进行发酵筛选，最终得到用于催化羊毛甾醇生成灵芝三萜的CYP基因CYP5150L8，即GL24883，其核苷酸序列如Seq No.1所示，氨基酸序列如Seq No.2所示，从而实现灵芝三萜的异源生物合成；

所述的筛选原则包括：

①通过筛选和灵芝三萜前体物质羊毛甾醇合成酶物理位置最靠近的两个CYP基因以及在灵芝的生长过程中和LSS共表达的78个CYP基因，以及

②灵芝细胞受到外界环境刺激后伴随灵芝三萜含量提高同时，自身转录水平也提高的CYP基因，具体是指：添加茉莉酸甲酯诱导后灵芝三萜产量提高同时有四个CYP基因转录上调；在灵芝发酵培养由震荡转为静置灵芝三萜含量提高同时有一个CYP基因转录上调。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的异源表达具体是指：通过PCR扩增候选的各个CYP表达序列片段，通过同源重组的方法将表达载体pRS426、CYP表达片段、酵母HXT7p启动子和酵母FBA1t终止子重组连接，得到一系列重组表达质粒pRS426HF-CYPs。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的发酵筛选具体是指：通过标准的醋酸锂转化法，将各个表达质粒导入酿酒酵母后，通过YPD培养基、YPD40培养基或YPD40F培养基发酵，随后对发酵产物经乙酸乙酯萃取，随后减压蒸馏除去乙酸乙酯，再用甲醇重悬，最后通过HPLC分析观察是否有新峰产生，从而初步判断所转化的CYP基因是否是所需的目的基因；

所述的YPD培养基成分为酵母粉10g/L，牛肉蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L；

所述的YPD40培养基成分为酵母粉10g/L，牛肉蛋白胨20g/L，葡萄糖40g/L；

所述的YPD40F培养基成分为酵母粉10g/L，牛肉蛋白胨20g/L，葡萄糖40g/L，赖氨酸0.173g/L，KH₂PO₄ 0.314g/L，MgSO₄·7H₂O 0.177g/L，K₂SO₄ 0.121g/L，Na₂SO₄ 0.019g/L。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的重组酿酒酵母为基因工程改造后的BY4742菌株。