[发明专利]通过合成生物学手段异源生物合成灵芝酸的方法

说明书

一种采用合成生物学手段异源生物合成灵芝酸的方法，通过挖掘和灵芝三萜生物合成相关的细胞色素P450酶(CYP)基因，并在酿酒酵母细胞异源表达该基因来进行筛选鉴定，并对酵母工程菌株的发酵产物进行分离纯化、质谱和核磁共振等分析，确定其为3‑hydroxy‑lanosta‑8,24‑dien‑26‑oic‑acid(灵芝酸Z)。本发明包含从灵芝三萜生物合成催化元件的挖掘，发酵表型初筛与元件功能鉴定，到最终获得异源生物合成的灵芝三萜类物质等一系列的设计及验证，也为异源生产其它灵芝三萜类活性物质提供了范例。

技术领域

本发明涉及的是一种生物工程领域的技术，具体是一种生物合成灵芝三萜类物质的方法。

背景技术

灵芝(Ganoderma lucidum)是中国传统的名贵药用高等真菌，对于辅助肿瘤治疗、抗HIV、提高人体免疫力、延缓衰老等具有显著功效(Sliva,2004)。灵芝这些独特的功效和其胞内具有生理活性的次级代谢产物密切相关，尤其是灵芝三萜类物质(Qin et al.,2016)。目前已从灵芝中分离得到了约200种灵芝三萜类物质(Baby et al.,2015)，它们具有不同的生理功能，例如，灵芝酸T和灵芝酸Me具有抗人肺癌细胞转移的作用(Tang etal.,2006；Chen et al.,2008)，灵芝酸GS-2可抑制HIV病毒的复制(Sato et al.,2009)。

栽培灵芝生长周期长、三萜类产物含量不高且易受环境因素影响。目前主要通过液体深层发酵生产灵芝三萜。通过对发酵条件的优化、补料发酵工艺以及对菌株的代谢工程改造有效提高了灵芝酸的产量，但灵芝三萜的产量仍处于毫克每升的水平(Tang etal.,2009)，由于细胞生长较慢，生产效率不高，难以满足大规模临床试验的用量要求(Liet al.,2016)。

合成生物学的发展为利用快速生长的微生物来异源表达植物类次生代谢产物生物合成基因，提供了一种有潜力的生产途径。近年，酿酒酵母已被国内外多个研究小组用于异源合成数种重要的植物天然化合物(Ajikumar et al.,2008；Dai et al.,2014；Yan etal.,2014)。灵芝三萜是通过甲羟戊酸途径(Mevalonate pathway)生物合成的。同位素示踪实验证实羊毛甾醇(Lanosterol)为灵芝三萜的生物合成前体(Yeh et al.,1989)。研究者们推测通过一系列包括细胞色素P450酶(Cytochrome P450，CYP)在内的对羊毛甾醇的羟化等反应(Xiao and Zhong,2016；Yeh et al.,1989)，从而生成不同种类的灵芝三萜，但目前仍未见关于灵芝三萜异源生物合成的报道。

发明内容

本发明针对现有人工栽培灵芝或灵芝深层发酵的宿主生长缓慢之不足，提出一种通过合成生物学手段异源生物合成灵芝三萜类物质的方法，具体来讲是通过挖掘鉴定和灵芝三萜生物合成相关的CYP基因，并在酿酒酵母细胞异源表达，从而实现异源合成灵芝三萜。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种通过合成生物学手段异源生物合成灵芝酸的方法，首先依据筛选原则从灵芝基因组中选择可能参与灵芝酸生物合成的CYP基因，然后分别将其克隆到酵母表达质粒，并将酵母表达质粒分别转化至重组微生物酿酒酵母中进行异源表达，通过对转化后的菌株进行发酵筛选，最终筛选得到用于催化羊毛甾醇生成灵芝三萜的CYP基因CYP5150L8(即GL24883)，从而实现灵芝三萜的异源生物合成。

所述的筛选原则包括：

①通过筛选和灵芝三萜前体物质羊毛甾醇合成酶(lanosterol synthase，LSS)物理位置最靠近的两个CYP基因以及在灵芝的生长过程中和LSS共表达的78个CYP基因(Chenet al.,2012)，以及