[发明专利]一种大规模制备动物富血小板血浆的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种大规模制备动物富血小板血浆（PRP）的方法。

背景技术

已发表的PRP文献数量众多，由于制备方法、术语使用、发表形式以及PRP广大的应用范围，报道的结果有许多出入。

根据包含细胞种类及纤维蛋白结构的不同，现行的制备富血小板血浆主要分为四类：

一、纯富血小板血浆（P-PRP），或无淋巴细胞富血小板血浆（Leucocyte-PRP）：该类PRP不含白细胞，激活后形成低密度纤维蛋白网络结构；

二、含淋巴细胞富血小板血浆（L-PRP）：包含白细胞，激活后形成低密度纤维蛋白网络结构，商品化PRP及实验用PRP多为此类；

三、纯富血小板纤维蛋白（P-PRF），或无淋巴细胞富血小板纤维蛋白，不含淋巴细胞，具高密度纤维蛋白网络结构，该类产品以高度激活的凝胶形式存在，不能用于注射以及传统纤维蛋白凝胶用途；

四、含淋巴细胞富血小板纤维蛋白（L-PRF），或次生PRP，含白细胞，含高密度纤维蛋白网络结构。

制备PRP的方法众多，建立的不同方法均基于PRP法以及白膜层法。在PRP法中，第一次离心分离去除红细胞，抗凝血离心后分为三层，上层包含绝大多数血小板及白细胞，中间层即白膜层，富含白细胞，底层绝大部分为红细胞。制备P-PRP时，取上层及中间层的表层部分；

制备L-PRP时，取上层、中间层及下层的表层部分。第二次离心时，选取合适的离心力使血小板（红细胞-血小板）在离心容器底部松散聚集，上层1/3体积为PPP，下层2/3体积重悬后即为PRP。

白膜层法分离PRP第一次离心使用高离心力，上层为PPP，白细胞和血小板集中于中间白膜层，转移白膜层进行第二次低速离心，去除白细胞。

见报道的有很多制备PRP的方法，各自基于不同侧重点进行，如制备体积、抗凝剂的使用、离心次数、离心时间等，造成了产品稳定性和可重复性的问题，大规模制备动物PRP尚未见报道。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种稳定性好、可重复性的大规模制备动物富血小板血浆（PRP）的方法。

为达到上述目的，本发明是通过以下的技术方案来实现的。

一种大规模制备动物富血小板血浆的方法，包括以下步骤：

（1）采血：对动物进行采血，将动物血液收集到离心瓶中，加入抗凝剂，使血液与抗凝剂充分混匀，避免凝血；其中抗凝剂占血液的体积比为4~7%，

（2）采好的血液在20-24℃条件下静置，得到抗凝血，所述抗凝血于2小时内进行离心分离；

（3）第一次离心：将步骤（2）得到的抗凝血移入15~50 mL无菌离心管，配平后放入离心机离心，离心的条件为：转速2300 ~2600rpm，时间15 ~18min，温度20-22℃；

（4）第二次离心：转移第一次离心后得到的上层及白膜层至15~50 mL无菌离心管中，配平后放入离心机离心，离心的条件为：转速3800 ~4100rpm，时间15 ~18min，温度20-22℃；

（5）分离PPP：上层1/2体积血浆为PPP；

（6）分离PRP：下层1/2体积血浆轻柔吹打混匀，为PRP。

进一步地，所述的抗凝剂为质量浓度为5%的柠檬酸钠溶液。

进一步地，所述的抗凝剂占血液的体积比为5%。

进一步地，步骤（3）中，第一次离心分离的条件：转速2500 rpm，时间15 min，温度20℃。

进一步地，步骤（4）中，第二次离心分离的条件：转速4000 rpm，时间15 min，温度20℃。

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点在于：

1、处理量大：能批处理量血液；

2、稳定：大体积处理最大程度降低了批次数，满足用户稳定性需求；

3、避免激活：室温处理，避免激活血小板启动凝集反应形成纤维蛋白交联网络。

4、及时：血小板室温下半衰期为7天，该制备方法能保证处理的时效性，最大程度保证了血小板的活力。

5、无菌：全程采用无菌操作，避免污染风险。

具体实施方式

下面结合实例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1：大规模制备山羊富血小板血浆

制备方法包括以下步骤：