[发明专利]蜜蜂肽聚糖识别蛋白的制备方法

权利要求书

1.一种蜜蜂肽聚糖识别蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)、将蜜蜂PGRP-SA的基因片段连接表达载体并转化至大肠杆菌进行表达，收集表达得到的包涵体蛋白；

2)、将所述包涵体蛋白洗涤后加入蛋白变性剂溶解，随后用复性液进行复性处理；

3)、将蛋白浓缩后依次经分子筛柱和阴离子交换柱洗脱纯化。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述蜜蜂PGRP-SA的基因片段如SEQ ID NO:1所示。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述蜜蜂PGRP-SA的基因片段的获取方法为：

以蜜蜂cDNA为模板，以SEQ ID NO:2所示的上游引物和SEQ ID NO:3所示的下游引物进行扩增；

优选的，退火温度为53℃～57℃，循环次数为28～32次。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述表达载体为PET21a+载体。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤2)中，洗涤所述包涵体蛋白时所用的洗涤液选自洗涤液A和/或洗涤液B；

所述洗涤液A的成分包括0.4％～0.6％(v/v)Triton-100，45～55mM Tris-Cl，280～320mM NaCl，8～12mM EDTA-Na₂，8～12mM DTT，pH＝7.8～8.2；

所述洗涤液B的成分包括45～55mM Tris-Cl，80～120mM NaCl，8～12mM EDTA-Na₂，8～12mM DTT，pH＝7.8～8.2；

优选的，用洗涤液A洗涤1～3次后再用洗涤液B洗涤1～2次。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述蛋白变性剂中包含5～7mol的盐酸胍；

优选的，所述蛋白变性剂的成分包括：

5～7M盐酸胍，8％～12％(v/v)甘油，45～55mM Tris，90～110mM NaCl，8～12mM EDTA-Na₂，8～12mM DTT，pH＝7.8～8.2。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述复性液的成分包括：

80～110mM Tris，380～420mM L-Arg HCl，1.8～2.2mM EDTA，4.5～5.5mM GSH，0.4～0.6mM GSSG，pH＝7.8～8.2。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述用复性液进行复性处理的条件为：

按16～20mg包涵体蛋白：100ml复性液的比例将包涵体蛋白加入复性液搅拌复性10h～14h；

优选的，在步骤3)中，所述浓缩为将500ml含有包涵体蛋白的复性液浓缩至3.5～4.5ml。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述分子筛柱为Superdex 200Increase；

优选的，所述分子筛柱洗脱的条件为：

室温，洗脱液的成分包括18～22mM Tris，45～55mM NaCl，pH＝7.8～8.2，以0.8～1.2ml/min的流速连续洗脱。

10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述阴离子交换柱为Resource Q；

优选的，所述阴离子交换柱的结合液为8～12mM Tris，8～12mM NaCl，pH＝7.8～8.2；

优选的，所述阴离子交换柱洗脱的条件为：

室温，洗脱液的成分包括8～12mM Tris，180～220mM NaCl，pH＝7.8～8.2，连续梯度洗脱，40～60min内连续流入45％～55％浓度的洗脱液。