[发明专利]蜜蜂肽聚糖识别蛋白的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种蜜蜂肽聚糖识别蛋白的制备方法。

背景技术

昆虫作为地球上种类最多的动物，目前已知的约有100万种，它们大多生活在充满病原微生物的恶劣环境中，在长期的进化选择压力作用下，昆虫形成了一套免疫防御体系来抵御这些病原微生物的入侵。

昆虫缺乏获得性免疫，仅依赖于先天免疫作为其防御机制。对于外来入侵的病原微生物来说，昆虫通过先天免疫系统进行抵抗，第一步是通过模式识别受体识别病原相关分子模式，从而激活下游反应。在昆虫中作为模式识别受体的有：肽聚糖识别蛋白(Peptidoglycan Recognition Proteins，PGRPs)、β-葡聚糖识别蛋白(β－Glucan Recognition Proteins，β－GRP)以及革兰氏阴性菌结合蛋白(Gram－neg－ative Binding Protein，GNBP)，但其中最主要的模式识别受体是肽聚糖识别蛋白。

PGRPs最初于家蚕的血淋巴中被发现，此蛋白结合细菌肽聚糖并激活酚氧化酶原级联反应-昆虫宿主抗菌防御机制。PGRP-SA为分泌型PGRPs，识别革兰氏阳性菌或真菌细胞壁肽聚糖(PGN)活化Toll信号通路诱导抗菌肽的表达，抵御细菌与真菌等病原微生物的入侵。蜜蜂基因组测序揭示了蜜蜂拥有4个PGRPs蛋白，在细菌感染刺激后其PGRP-SA蛋白的表达量显著上调。果蝇、小菜蛾与家蝇等昆虫的肽聚糖识别蛋白PGRP-SA已分别于昆虫Hi-5细胞、果蝇S2细胞、大肠杆菌(PET28a+载体)进行了表达；小菜蛾PGRP-SA蛋白的专利已申请专利并授权(公开号CN103484468A，公开日2014年1月1日)；上述昆虫PGRP-SA的研究中仅有果蝇PGRP-SA表达后，经纯化后，蛋白纯度达到90％以上。然而上述研究并没有形成昆虫的PGRP-SA蛋白规模化制备以及高纯度蛋白纯化的有效方法。

蜜蜂是众多野生植物与农作物的有效授粉昆虫，具有重要的经济价值与生态价值；同时，蜜蜂的健康受到细菌等多种病原微生物的威胁，其先天免疫系统中重要免疫分子肽聚糖识别蛋白PGRP-SA的体外制备尚未见有报道，这严重阻碍了蜜蜂新型抗菌免疫药物的研究与应用。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种蜜蜂肽聚糖识别蛋白的制备方法，该方法能够高效制备并复性获得高纯度、高均一性的活性目标蛋白。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种蜜蜂肽聚糖识别蛋白的制备方法，包括如下步骤：

1)、将蜜蜂PGRP-SA的基因片段连接表达载体并转化至大肠杆菌进行表达，收集表达得到的包涵体蛋白；

2)、将所述包涵体蛋白洗涤后加入蛋白变性剂溶解，随后用复性液进行复性处理；

3)、将蛋白浓缩后依次经分子筛柱和阴离子交换柱洗脱纯化。

在蛋白质的表达纯化过程中，复性问题一直是生物工程中的一个难点和热点。其关键问题来自于复性过程中聚集体的形成。当蛋白在高浓度下折叠复性时，伸展的肽链由于疏水基团的外露，更加容易由于疏水相互作用或者分子间的错配的二硫键形成聚集体。经典的复性方法一般采用稀释法和透析法，前者将变性蛋白直接加入复性缓冲液，高蛋白浓度下往往形成大量沉淀，因而复性时要求很低的蛋白浓度；而后者操作繁琐，不利于放大。超滤法复性可以将变性剂用复性缓冲液连续置换，使变性剂浓度缓慢降低，而蛋白浓度不会明显降低，而且便于自动化操作，但剪切力可能导致复性好的蛋白质重新变性而降低活性收率。其它改进的经典复性方法还有脉冲复性、滴加复性和膜管流加复性，它们均不能从根本上解决聚集沉淀的问题。

本发明采用的层析法复性是近年来基于层析分离原理的基础上发展起来的一种新的复性方法。这种方法对蛋白比较温和，处理的蛋白浓度可以很高，操作简单、周期短，被广泛用于进行蛋白质复性，因此逐渐发展成一种将纯化和复性结合起来的复合式纯化方法。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

对蜜蜂PGRP-SA蛋白表达条件进行了优化，优选了各过程中重要试剂的配方，结合采用层析法复性，方法简单快速，操作过程温和，对蛋白损伤小，获得了高纯度的活性蛋白质。

附图说明