[发明专利]RT-LAMP检测结核分枝杆菌活菌的引物组合物、相应的试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种RT-LAMP检测结核分枝杆菌活菌的引物组合物，其特征在于：所述RT-LAMP的引物组合物包括：

正向外引物F3：5’-TCCTGGCTCAGGACGAAC-3’；

反向外引物B3：5’-CGCTTTCCACCACAAGACAT-3’；

正向内引物FIP：5’-TCGCCACTCGAGTATCTCCGAAGCGGCGTGCTTAACACAT-3’；

反向内引物BIP：5’-AGTAACACGTGGGTGATCTGCCATCCCGTGGTCCTATCCG-3’；

反向环引物LB：5’-ATAAGCCTGGGAAACTGGGT-3’；

所述RT-LAMP的引物组合物设计步骤依次为：1）下载非结核杆菌16S rRNA全序列，将结核杆菌标准株与非结核杆菌进行序列对比，所述非结核杆菌包括：胞内分枝杆菌、海分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、鸟结核分枝杆菌、浅黄分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌；2）基于1）根据两个高变区170-210bp和430-490bp，确定特异引物的设计区段，设计引物并验证特异性。

2.一种用于检测结核分枝杆菌活菌的RT-LAMP试剂盒，包括RT-LAMP扩增反应液，其特征在于：所述RT-LAMP扩增反应液为25μL，包括如权利要求1所述的RT-LAMP检测结核分枝杆菌活菌的引物组合物；所述RT-LAMP检测结核分枝杆菌活菌的引物组合物包括0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3、1.6μM正向内引物FIP、1.6μM反向内引物BIP、0.8μM反向环引物LB；所述RT-LAMP扩增反应液还包括0.8 M 甜菜碱、8mM MgSO₄、1.4 mM dNTPs，8 U BstDNA聚合酶、20 U重组核糖核酸酶抑制剂、100U M-MLV反转录酶、2.5μL 10×buffer，1μL模板RNA，5mM/μL钙黄绿素、10mM/μL MnCl₂、11.7μL去离子水。

3.一种非诊断目的的RT-LAMP检测结核分枝杆菌活菌的方法，其特征在于，它利用权利要求2所述的用于检测结核分枝杆菌活菌的RT-LAMP试剂盒进行检测。

4.根据权利要求3所述的RT-LAMP检测结核分枝杆菌活菌的方法，其特征在于，它按照如下的步骤顺序进行：

（1）在反应管中加入0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3、1.6μM正向内引物FIP、1.6μM反向内引物BIP、0.8μM反向环引物LB、0.8 M 甜菜碱、8mM MgSO₄、1.4 mM dNTPs，8 UBst DNA聚合酶、20 U重组核糖核酸酶抑制剂、100U M-MLV反转录酶、2.5μL 10×buffer、1μL模板RNA、5mM/μL钙黄绿素、10mM/μL MnCl₂和11.7μL去离子水，并将反应管置于恒温水浴箱内反应；

（2）将步骤（1）的反应管置于90℃恒温水浴箱内2min，终止反应，根据反应管中液体的颜色变化判断扩增结果。

5.根据权利要求4所述的RT-LAMP检测结核分枝杆菌活菌的方法，其特征在于：所述恒温水浴箱的温度为60-65℃，反应时间为30-50 min。

6.根据权利要求5所述的RT-LAMP检测结核分枝杆菌活菌的方法，其特征在于：所述恒温水浴箱的温度为60℃，反应时间为30 min。