[发明专利]RT-LAMP检测结核分枝杆菌活菌的引物组合物、相应的试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了一种RT‑LAMP检测结核分枝杆菌活菌的引物组合物和试剂盒，该引物组合物的设计合理，特异性强；含有该引物组合物的试剂盒特异性强、灵敏度高，操作方便，可通过肉眼观察扩增结果；本发明还提供一种RT‑LAMP检测结核分枝杆菌活菌的检测方法，该方法简单，灵敏度高，检测过程便捷，扩增反应快，节省时间，扩增结果通过肉眼即可观察，能特异性检测死菌或活菌。本发明适用于检测结核分枝杆菌活菌。

技术领域

本发明属于分子检测技术领域，涉及一种引物组合物、试剂盒和检测方法，具体地说是一种RT-LAMP检测结核分枝杆菌活菌的引物组合物、相应的试剂盒及检测方法。

背景技术

结核病是由结核分枝杆菌引起的严重影响人类健康的慢性传染病，是至今仍然困扰人类的古老疾病之一，在古埃及木乃伊中就已发现结核分枝杆菌的存在，即使在最近几年, 每年还大约有900万人感染结核。随着耐药与多重耐药菌株的出现，结核病的控制难度不断增加，而建立快速、灵敏度高、特异性强的诊断方法，对于结核病的防治工作具有重要意义，也是进行早期隔离、诊治的前提。

目前，结核病的诊断方法主要是痰涂片抗酸染色法、罗氏固体培养法、液体快速培养、核酸扩增等方法。染色涂片虽然简单易行，但敏感性差，检出率低，并且不能鉴别是死菌还是活菌，亦不能分辨结核分支杆菌与非结核分枝杆菌；罗氏固体培养法培养周期长，需要4-8周，改进后液体快速培养系统将时间缩短到10天左右，但花费昂贵且容易受到污染，只能检出活力旺盛的菌，并且培养法不能鉴别结核分支杆菌与非结核分枝杆菌；以扩增核酸为基础的实验技术，具有快速、灵敏、特异强等特点，比如PCR、LAMP等；但因PCR技术对操作人员技能有较高要求，需要的热循环设备格昂贵而很难得到推广，环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）克服了上述缺点，具有反应快速、操作简单的优势，一台水浴锅等恒温设备即可完成操作，扩增结果可用肉眼判定，对员工简单培训即可完成操作，适合在基层医疗机构应用，但PCR、LAMP等分子生物学检测法是针对结核杆菌DNA基因为靶序列设计的引物并进行扩增的，对死菌或活菌都呈现阳性结果，无法在临床上评估抗结核治疗效果。

发明内容

本发明要解决的技术问题，是要提供一种RT-LAMP检测结核分枝杆菌活菌的引物组合物及相应的试剂盒，该引物组合物的序列设计合理，特异性强，灵敏度高；含有该引物组合物的试剂盒特异性强、灵敏度高，操作方便，可通过肉眼观察扩增结果；

本发明的另外一个目的，是提供一种RT-LAMP检测结核分枝杆菌活菌的方法，该方法简单，灵敏度高，检测过程便捷，扩增反应快，节省时间，30min内即可完成扩增，扩增结果通过肉眼即可观察，能特异性检测死菌或活菌。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

一种RT-LAMP检测结核分枝杆菌活菌的引物组合物，它包括：

正向外引物F3：5’-TCCTGGCTCAGGACGAAC-3’；

反向外引物B3：5’-CGCTTTCCACCACAAGACAT-3’；

正向内引物FIP：5’-TCGCCACTCGAGTATCTCCGAAGCGGCGTGCTTAACACAT-3’；

反向内引物BIP：5’-AGTAACACGTGGGTGATCTGCCATCCCGTGGTCCTATCCG-3’；

反向环引物LB：5^，-ATAAGCCTGGGAAACTGGGT-3^，

本发明提供了一种用于检测结核分枝杆菌活菌的RT-LAMP试剂盒，包括25μL 的RT-LAMP扩增反应液，所述RT-LAMP扩增反应液包括如下组分：