[发明专利]一种基于单个量子点的用于检测DNA甲基转移酶的纳米传感器

说明书

技术领域

本发明属于生物分析技术领域，具体涉及一种基于单个量子点的用于检测DNA甲基转移酶的纳米传感器。

背景技术

DNA甲基化是细胞中主要的表观遗传修饰，在各种重要细胞过程中起关键作用，如基因调控，染色质结构维持和细胞发育。DNA甲基化由DNA甲基转移酶(MTases)家族催化。通过将甲基从S-腺苷甲硫氨酸(SAM)转移到特定DNA序列中的腺嘌呤或胞嘧啶残基，DNA甲基转移酶可以建立和维持一定的基因组甲基化模式。异常的DNA甲基转移酶活性可能会干扰正常的甲基化模式，导致包括癌症在内的许多疾病的发生。例如，DNA甲基转移酶(1,3a和3b)的过表达与视网膜母细胞瘤的肿瘤发生密切相关。胞嘧啶DNA甲基转移酶的活性在结肠癌进展期间增加。在非小细胞肺癌中DNA甲基转移酶-1的表达升高。此外，通过特异性抑制剂抑制DNA甲基转移酶活性为人类癌症的治疗提供了新的机会。因此，DNA甲基转移酶的准确检测以及抑制剂的筛选对于疾病诊断和治疗至关重要。

目前，DNA甲基转移酶检测的标准方法是基于其辅因子的放射性标记([甲基-³氢]-S-腺苷甲硫氨酸)，然而放射性物质的参与大大限制了该方法的广泛应用。为了避免放射性污染，已经开发了非放射性高效液相色谱(HPLC)测定法，但是该方法过程繁琐，耗时多。最近，建立了各种新方法，包括比色法，化学发光法，荧光法，电化学法等。虽然这些方法为DNA甲基转移酶的定量检测提供了有效的平台，但是它们仍然不足以灵敏的检测非常低丰度的靶标。为了提高检测的灵敏度，已经引入了几种信号扩增方法用于DNA甲基转移酶的检测，例如核酸外切酶III辅助的靶循环，核酸内切酶辅助的扩增，双链特异性核酸酶辅助扩增，滚环扩增(RCA)和链置换扩增(SDA)。在这些方法中，DNA甲基转移酶的检测限已大大改善，然而，它们需要繁琐的多重探针和扩增模板来完成信号扩增步骤，并且由于非特异性扩增经常产生高背景信号。与传统的荧光蛋白和有机染料相比，半导体量子点具有光稳定性好，量子产量高，宽激发，窄发射的独特光学特性，已经广泛应用于生物成像和生物传感领域。然而迄今为止，鲜有通过整合单分子荧光检测和量子点技术用于检测DNA甲基转移酶的报道。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提出一种基于单量子点的纳米传感器，所述纳米传感器仅涉及单个检测探针，避免了复杂的检测设计和繁琐的信号放大步骤，同时具有对DNA甲基转移酶的高选择性与高灵敏度。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

首先，本发明提供一种基于单量子点的纳米传感器，所述纳米传感器包括：

3'末端生物素化的发夹检测探针，所述检测探针5'末端标记荧光团花菁5(Cy5)，3'末端还标记有猝灭基团黑洞猝灭剂(BHQ2)，茎区包含靶DNA甲基转移酶的识别序列5'-GATC-3'；

表面包被链霉亲和素的量子点；

所述探针通过链霉亲和素-生物素相互作用连接到链霉亲和素修饰的量子点表面上，形成量子点/探针/花菁5/黑洞猝灭剂复合物；

所述纳米传感器还包括甲基化特异性核酸内切酶(DpnI)。

本发明所述的纳米传感器，依靠量子点/探针/花菁5/黑洞猝灭剂复合物中Cy5与量子点的荧光共振能量转移，对于荧光分子Cy5的选择，虽然现有技术已有多种可与量子点发生荧光共振能量转移的荧光染料分子，如TAMRA/Cy3/Texas Red/罗丹明等，但发明人通过对比试验研究发现，QD/Cy5这一对组合在本发明所述方法中的荧光共振能量转移(FRET)效率更高。

优选的，所述发夹检测探针长度为36nt，所述发夹检测探针的碱基序列为：5'-black hole quencher 2(BHQ2)-ACA GTG ATC ATT GTT TTC AAT GAT CAC TGT-Cy5-TTT TTT-Biotin-3'；

优选的，本发明所述量子点为605QDs；本发明所述605QDs是指从公司Invitrogen Corporation(California,U.S.A.)购买得到的Qdot 605ITK，它是一种streptavidin-coated CdSe/ZnS QDs，最大发射波长为605nm。

优选的，所述纳米传感器还包括S-腺苷甲硫氨酸和甲基化特异性核酸内切酶反应缓冲溶液；