[发明专利]一种判别猕猴桃溃疡病抗性种质的方法

说明书

本发明公开了一种判别猕猴桃溃疡病抗性种质的方法，利用猕猴桃溃疡病菌的寄生特性和猕猴桃对溃疡病的抗性生理特点，适用枝条离体接菌的方式，先期通过较低温度使病原菌处于较易增殖和侵染的状态培养较长一段时间，后期提高温度到适宜猕猴桃枝条生长和萌芽的温度继续培养。通过观察枝条剪口是否出现愈伤组织或枝条能否萌芽将抗性种质筛选出来。该方法简单、直观，准确性高。因为在室内操作，降低了传播溃疡病菌的风险。该发明将推动对现有猕猴桃各品种或种质的溃疡病抗性的认识，鉴别出一系列优异的溃疡病抗性种质材料，用于猕猴桃生产和进一步开发利用，减少溃疡病的危害，促进猕猴桃产业健康、可持续发展。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体是一种通过离体枝条低温接菌培养后再提高培养温度，根据接菌后的枝条是否产生愈伤或萌芽的方法判别猕猴桃溃疡病抗性种质的方法。

背景技术

猕猴桃溃疡病是一种威胁世界猕猴桃生产的毁灭性病害，因其病原菌能侵染到植物组织内部，一般农药很难起到作用，即使是各种措施综合使用，效果仍不明显。生产实践证明，凡发生溃疡病的猕猴桃果园，特别是品种较感病园，已基本毁园。通过多年的生产经验，人们发现选育抗病品种是目前防控猕猴桃溃疡病的唯一有效办法，但目前已知的猕猴桃溃疡病抗性种质十分有限，主要原因是猕猴桃溃疡病抗性的鉴定方法不完善。以前人们对猕猴桃品种溃疡病抗性的认识大多是根据其田间感病状态确定的，但由于猕猴桃抗病性田间观察受病原菌的传播情况及年度间气候、地理环境等的影响较大，抗病品种的田间鉴定往往需要漫长的观察周期。针对此现象，部分科研人员发展了离体叶片和枝条的体外接种鉴定技术，在猕猴桃抗、感品种的鉴定上有一定的效果，但仍存在鉴定结果的准确性不高，适用范围窄等问题，缺乏系统性的鉴定和评价体系，导致对目前大部分的猕猴桃品种或野生种质材料的溃疡病抗性认识不足，限制了优异抗性品种或野生种质材料的发掘和利用。本发明利用猕猴桃溃疡病菌的寄生特性和猕猴桃对溃疡病的抗性生理特点，建立了一种简单有效可操作性强的鉴别溃疡病抗性种质的方法，此方法对猕猴桃溃疡病抗性种质的鉴定准确性高，适用于大部分猕猴桃种类。

发明内容

本发明针对目前猕猴桃溃疡病抗性鉴定和评价方法的缺点和不足，和大部分猕猴桃品种或种质对溃疡病的抗性不明的现象，通过对猕猴桃离体枝条接种溃疡病菌后，先期通过低温培养，后期提高培养温度，根据枝条愈伤组织的形成或萌芽状态来判别猕猴桃溃疡病抗性种质的方法。该方法简单、直观、可操作性强，判别结果准确性高。

本发明一种判别猕猴桃溃疡病抗性种质的方法，包括如下步骤：

（1）样品采集：于猕猴桃休眠期采集落叶后的猕猴桃一年生枝条，截取中间部分约30 cm长，芽眼饱满的枝条，每个品种或种类取5个枝条，设无菌水处理为对照；

（2）病原菌培养：从保存的固体培养基平板上挑取单克隆，加入50 mL液体LB培养基，25℃，220rpm，震荡培养48h，4000rpm离心获得细菌沉淀，使用无菌水将病原菌悬浮液稀释到1×10⁹ cfu/ml；

（3）样品接菌：样品取回实验室后，使用自来水将枝条冲洗干净，晾干，然后使用75%酒精对枝条表面进行快速消毒，时间20s；再用无菌水冲洗干净后，晾干，使用消毒后的5mm打孔器在枝条中部位置打孔，打孔深度深入木质部，用枪头吸取10 μl菌液注入孔内，放置15min使菌液完全渗入枝条伤口内；

（4）枝条低温培养：取一消毒后的40cm长芽苗盘，在上层沥水盘内铺两张无菌滤纸，在底层托盘内加入无菌水，加水高度至与上层沥水盘底部齐平，不要没过滤纸，使滤纸可以吸取水分保持湿度；将接菌后的枝条伤口朝上，摆放于滤纸上，每个枝条的摆放方向一致，当芽苗盘摆满一层后，上面覆盖另外两张无菌滤纸，并喷无菌水使其浸透为止；最后将要培养的芽苗盘至于无菌气候室内，控制温度10℃以下，每3天检查一次，如果发现滤纸部分变干则及时喷淋无菌水保湿，低温培养时间为35天；

（5）提高培养温度：低温培养35天后，提高培养温度到20℃，继续培养15天；