[发明专利]引入外源多肽的活细胞脂质体及其应用

权利要求书

1.一种引入外源多肽的活细胞脂质体，其特征在于：以经Δ6-去饱和酶基因重组的工程菌为载体，引入外源多肽被包裹进经Δ6-去饱和酶基因重组的工程菌的脂滴内。

2.根据权利要求1所述的一种引入外源多肽的活细胞脂质体，其特征在于：所述外源多肽是α-MSH或者多肽H22LP。

3.根据权利要求2所述的一种引入外源多肽的活细胞脂质体，其特征在于：所述工程菌为导入Δ6-去饱和酶(D6D)基因重组的粘红酵母GM4-D6D。

4.根据权利要求3所述的一种引入外源多肽的活细胞脂质体，其特征在于：所述Δ6-去饱和酶由刺孢小克银汉霉的D6D基因的分离与扩增得到的。

5.根据权利要求3所述的一种引入外源多肽的活细胞脂质体，其特征在于：Δ6-去饱和酶(D6D)基因重组的粘红酵母的构建方法,其包括的步骤如下：

(1)表达载体pPGK1Z-rD-ME的抽提；

(2)连接PGK1基因和D6D基因；

(3)PGK1-D6D片段与表达载体载体的双酶切反应、连接。

6.根据权利要求5所述的一种引入外源多肽的活细胞脂质体，其特征在于：表达载体pPGK1Z-rD-ME的抽提的方法的步骤如下：

(1)将含有pPGK1Z-rD质粒的大肠杆菌DH5α接种到装有5mL LB-amp培养基中，于37℃下250rpm振荡培养过夜；

(2)吸取1.5mL过夜菌液于离心管中，4℃下12000rpm离心1分钟，弃上清；

(3)用滤纸吸干离心管中的液体培养基，将菌体沉淀悬浮于200μLSTET缓冲液中，用涡旋混合器混匀；

(4)加入4mL溶菌酶溶液，混匀后于室温下静置5分钟；

(5)用漂子架住离心管，置于沸水浴中，精确记时45秒，取出后立刻12000rpm离心5分钟；

(6)用无菌牙签挑取离心管中的沉淀物弃去，离心管的上清液中加入8mL 5％CTAB，用混合器混匀后，13000rpm离心5分钟，弃上清液，用滤纸吸干离心管中的液体；

(7)加入1.2M NaCl 300mL，充分溶解沉淀物，再加入750mL的预冷乙醇，充分混匀后，13000rpm离心15分钟，弃上清液；

(8)取1mL 70％冷乙醇，缓慢淋洗离心管内壁，13000rpm离心5min，弃上清液，用滤纸吸干管壁上的液体，置室温中使核酸沉淀自然干燥5-10min；

(9)沉淀物溶于50mL TE缓冲液中，混合器混匀，于-20℃保存备用。

7.根据权利要求6所述的一种引入外源多肽的活细胞脂质体，其特征在于：粘红酵母与D6D基因片段的摩尔比要控制在1:3-10。

8.一种引入外源多肽的活细胞脂质体的制备方法，其特征在于：包括的步骤如下：

(1)制备工程菌株GM4-D6D菌株感受态细胞；

(2)将10μg修饰了的外源多肽溶解后与感受态细胞混合后共100μL，加入电转化杯中；

(3)电击化；

(4)电击结束后，立即向转化杯中加入900μL预冷的1M山梨醇溶液，用枪轻微吸打混匀，然后将其转至灭过菌的离心管中，30℃静置1h，离心后加入1mL新鲜的YPD培养基重悬菌体，30℃，200rpm摇1小时；

(5)得到的菌株。

9.根据权利要求8所述的一种引入外源多肽的活细胞脂质体的制备方法，其特征在于：所述电击化步骤如下：

(1)将80μL己制备好的感受态细胞与20μL已线性化好的待转化质粒DNA混合,加入到0.2cm已预冷的电转化杯中；

(2)将装有混合液的电转化杯冰浴5min；

(3)调整好电转仪的参数:电压1.5kV，电容25uF，电阻200Ω，电击持续时间为5ms；

(4)电击结束后，立即向转化杯中加入1mL预冷的1M山梨醇溶液,用枪轻微吸打混匀,然后将其转至灭过菌的离心管中,30℃静置1h，然后加入1mL新鲜的YPD培养基，30℃，200rpm摇1小时；

(5)室温下3000rpm，离心4min，用200μL ddH2O重悬菌体；

(6)将消液涂布于含50μL Zeocin的YPD平板，置于30℃培养箱中培养2-3d,直到长出单菌落为止。

10.根据权利要求1所述的一种引入外源多肽的活细胞脂质体，其特征在于：在多肽相关药物和肽类分子相关功能性食品制备中的应用。