[发明专利]引入外源多肽的活细胞脂质体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种引入外源多肽的活细胞脂质体及其应用。

背景技术

许多不饱和脂肪酸因其广泛的生理活性和其在人类健康、营养方面的重要作用越来越受人们关注；多肽药物又因其半衰期短、易被酶降解而限制了应用。

微生物油脂的合成过程与动植物几乎相似，最主要的部分就是脂肪酸的合成，主要有两种胞质酶系催化，乙酰CoA羧化酶和脂肪酸合酶复合体，以乙酰CoA为碳源经过多次碳链延长合成饱和脂肪酸，或再经过去饱和作用合成不饱和脂肪酸。在去饱和过程中主要由各种去饱和酶负责催化，是合成长链不饱和脂肪酸的关键，能在脂肪酸碳链上引入C＝C双键，提高脂肪酸的不饱和度，酵母中广泛存在脂肪酸去饱和酶。

而合成不饱和脂肪酸的酶分为两种，甲基定向和羧基定向的脂肪酸去饱和酶。甲基定向的脂肪酸去饱和酶从甲基端固定的碳原子处引入碳碳双键，被称为ω-去饱和酶；羧基定向的脂肪酸去饱和酶从羧基端固定的碳原子处引入碳碳双键，被称为Δ(delta)-去饱和酶，也称为“front-end”去饱和酶。Δ9-去饱和酶将第一个碳碳双键引入饱和脂肪酸中，第二个碳碳双键由Δ12和Δ6-去饱和酶负责引入，Δ15去饱和酶则负责引入第三个双键。

在细胞合成18C饱和脂肪酸后，硬脂酸经硬脂酰-CoA去饱和酶去饱和得到油酸；油酸经Δ12-去饱和酶催化生成亚油酸，经Δ15-去饱和酶合成α-亚麻酸(ALA)；亚油酸经Δ6-去饱和酶催化生成γ-亚麻酸GLA。其中，Δ6-去饱和酶是GLA合成途径中的关键酶，第一次克隆出Δ6-去饱和酶是1993年从蓝藻中分离克隆得到的，第一次通过生物技术获得GLA是在1996年在土豆中表达蓝藻的Δ6-去饱和酶基因生产GLA。GLA在人体中进一步脱氢延长形成花生四烯酸(AA)、前列腺素类和白三烯类等生理活性物质，对人体有重要生理意义，因而近年人们对Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的研究热度较高，也取得了较大进展。

虽然已经有多篇报道表明，表达外源Δ6-脂肪酸脱氢酶在酵母中会使GLA含量增加，但是迄今为止，尚未出现利用基因工程构建可以高产γ-亚麻酸(GLA)的酵母菌菌株的报道。

α-黑素细胞刺激素(α-melanocyte-stimulating hormone，α-MSH)是属于黑皮质家族，是由阿黑皮素原(POMC)派生出来的一种内源性神经肽，由13个氨基酸构成的短肽，在自然界以阳离子的形式存在，是所有黑皮质激素肽的前体蛋白，由脑垂体负责分泌表达。尽管α-MSH是由脑垂体产生的，但是在防御细胞、外周组织如皮肤都有它的身影，说明其免疫调节特性。α-MSH的生理特性说明了其在机体免疫特别是固有免疫中的重要性以及在抗菌方面也可发挥重要作用。目前对α-MSH应用比较广泛的是其抗炎症作用，因其能调节许多炎症因子，说明具有强大的抗炎功能。α-MSH对几乎所有类型的炎症都有强大的抑制作用，包括急性炎症、慢性炎症、系统炎症、局部炎症、过敏性炎症以及中枢神经系统的抗炎，作用可通过中枢、外周在多种内分泌、免疫调节系统发挥作用。但由于α-MSH本身也存在着缺点，其半衰期较短，在体内半衰期只有20多分钟，所以现行的给药方式是注射，且需不断注射来维持药效，给病人带来不便和痛苦，如果直接口服多肽，体内消化道的酶会将其降解，所以需要开发一种新的口服给药方式来实现这种肽的应用。

H22LP是我们实验室前期筛选得到的广谱趋化因子受体US28拮抗肽。US28作为人类巨细胞病毒(HCMV)编码的4个七跨膜趋化因子受体之一，是一个广谱的CC类炎症趋化因子受体，在HCMV感染的细胞中对β趋化因子的结合和钙流信号诱导起重要作用。我们通过对US28进行跨膜结构域和结合模拟位的预测，寻找出其N端与趋化因子激动的部位，合成相应部位的多肽，最终筛选出能阻断US28与其对应的CC类趋化因子相互作用、具有更少免疫原性和更强活性以用来作为拮抗剂的小分子先导物H22LP，经前期实验证明H22LP可以通过直接与病毒颗粒作用来达到抑制HCMV的效果。

多肽药物因其半衰期短、体内易被酶分解等特点不适合口服，从而限制了它的应用，需要探索新的口服载体。

发明内容

针对现有技术的不足之处，本发明的第一目的是提供一种引入外源多肽的活细胞脂质体。

本发明的第二目的是提供所述引入外源多肽的活细胞脂质体的应用。

为解决上述的技术问题，本发明采用如下技术方案：一种引入外源多肽的活细胞脂质体，以经Δ6-去饱和酶基因重组的工程菌为载体，引入外源多肽被包裹进所述经Δ6-去饱和酶基因重组的工程菌的脂滴内。