[发明专利]肿瘤免疫T细胞检测试剂盒和检测方法

说明书

技术领域

本发明属于精准生物医学检测领域，更具体地说，涉及利用定量PCR扩增检测与肿瘤免疫精准医疗临床前和临床研究相关的免疫系统特异基因在人体外周血液T细胞中的定量表达谱以及特异PCR引物。

背景技术

肿瘤免疫治疗是应用免疫学原理和方法，提高肿瘤细胞的免疫原性，增强机体免疫应答，并应用体外扩增免疫细胞或效应药物输注患者体内，协同机体免疫系统抑制肿瘤生长(Kershaw et al.,2013；Barrett et al.,2014；Melero et al.,2015)。上世纪五十年代Burnet和Thomas提出了“免疫监视”理论，认为机体中经常会出现的突变的肿瘤细胞可被免疫系统所识别而清除，为肿瘤免疫治疗奠定了理论基础(Burnet,1967)。近年来，肿瘤免疫治疗已在部分肿瘤类型如淋巴瘤、黑色素瘤、非小细胞肺癌等的治疗中表现出了极佳的抗肿瘤活性，一些肿瘤免疫治疗抗体药物已获得美国FDA(Food and Drug Administration,FDA)批准临床应用。肿瘤免疫治疗由于其突出的疗效和创新性，2013年美国《科学》杂志把肿瘤免疫治疗选为当年最大的科学突破(Science,2013)，2015年又将肿瘤免疫联合治疗列为最值得关注的四项科学进展之一(Travis,2015)。肿瘤免疫治疗有望成为继手术，化疗，放疗，靶向治疗后肿瘤治疗领域的一场革新。然而，免疫细胞对肿瘤细胞的有效识别，以及肿瘤细胞对免疫细胞活性的抑制，是肿瘤免疫治疗面临的挑战和难题。

CAR—T(嵌合抗原受体T细胞)肿瘤免疫治疗技术：T细胞表面表达激活性受体如：CD28、OX40、GITR、CD137、CD27、HVEM等，这些受体的激活能有效增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。针对免疫细胞特异识别肿瘤细胞有效性，CAR—T(嵌合抗原受体T细胞)疗法应运而生：即通过精确检测患者肿瘤细胞特异性，在体外对患者T细胞改造表达对自身肿瘤细胞特异的嵌合抗原受体，再回输到患者体内，让免疫系统高效特异识别并杀伤肿瘤细胞。如：alfaCD19.4-1BB.CD3zeta CARTs已开始用于淋巴瘤的临床治疗探索。

肿瘤免疫检查点抑制治疗技术：T细胞表面还表达免疫检查点抑制性受体如：CTLA4、PD1、GITR、TIM3、BTLA、LAG3等，这些受体的活化将抑制T细胞的抗癌功能。针对肿瘤细胞对免疫系统的抑制是通过激活免疫细胞的抑制性受体实现的，以抗体药物如PD—1(程序性细胞死亡1)抗体药物为代表的免疫检查点抑制疗法已用成功于多种肿瘤的免疫临床治疗。

免疫治疗T细胞检测试剂盒与检测方法：无论是CAR—T治疗技术还是免疫检查点抑制治疗技术的成功实施，需要前期个性化的精准检测，为治疗方法提供精确的靶点。现代生命科学与临床医学的进步，尤其是人基因组测序计划的完成，以及定量PCR技术等分子诊断检测技术的发展，为肿瘤的个性化精准检测与精准医疗提供了可能。然而，针对目前肿瘤免疫的免疫细胞定量PCR检测靶点不完善。针对目前肿瘤免疫存在的缺乏对免疫细胞受体和配体、细胞因子等基因表达的有效检测的问题：(1)在多种免疫细胞中，外周血液T细胞对肿瘤细胞有强的细胞毒性；(2)有多种激活性受体参与T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，而且不同类型的肿瘤对不同的激活性受体有响应性；(3)肿瘤细胞可能通过激活T细胞的抑制性受体，从而使T细胞失活，其中不同类型的肿瘤可能活化不同的抑制性受体通路；(4)在免疫治疗过程中可能产生不良的细胞因子风暴，要及时对治疗过程进行调整；(5)患相同肿瘤的患者之间有个体差异，需要进行个性化的肿瘤免疫治疗和其它诊治手段。

发明内容

为了解决现有技术中存在的不足之处，本发明提供一种肿瘤免疫T细胞检测试剂盒以及检测方法，其能够高效定量检测肿瘤免疫治疗前、治疗过程中与治疗后相关免疫细胞基因。

根据本发明的第一方面，提供了一种肿瘤免疫T细胞检测试剂盒，包括基于SYBR-Green定量PCR扩增对人体外周血液T细胞中免疫相关靶基因进行PCR扩增以检测其特异定量表达的特异引物(对)，所述免疫相关靶基因包括受体和配体相关靶基因、NK细胞相关靶基因以及关键细胞因子基因，