[发明专利]一种鉴别蒙古黄芪和膜荚黄芪的方法

权利要求书

1.一种鉴别蒙古黄芪和膜荚黄芪的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)原料预处理：将干燥的黄芪粉碎成粉末后过100目筛得到黄芪细粉，备用；

2)提取粗多糖：取上述黄芪细粉加水后在100℃的温度下回流提取1h，降至室温后离心取上清液；残渣再加水重复提取1次，取上清，合并上清液；浓缩，将合并的上清液用95％的乙醇调节至含醇量为80％，3000r/min离心10min，合并沉淀，冷冻干燥得多糖粗粉；

3)纯化多糖：将步骤2)得到的多糖粗粉溶于水中，得到多糖粗粉溶液，所述多糖粗粉与水的质量比为1:200，向多糖粗粉溶液中加入浓度为10.6％的亚铁氰化钾溶液和浓度为21.9％的乙酸锌溶液，所述浓度为10.6％的亚铁氰化钾溶液和浓度为21.9％的乙酸锌溶液的加入量均为多糖粗粉溶液体积的10％，振摇后静置30min，离心得到纯化多糖，冻干，备用；

4)多糖酸水解：取步骤3)得到的纯化多糖10mg，加入0.5mol/L三氟乙酸500μL，混匀，随后将混合液置于90℃保温1h，反应结束后，用氮吹干燥仪干燥多糖酸水解产物，然后加入适量甲醇清洗水解产物，继续氮气吹干；

5)多糖酸水解产物、三糖标准品和二糖标准品的衍生化：取三糖标准品6mg、二糖标准品2mg以及步骤4)中得到的多糖酸水解产物，分别加入200μL的NaCNBH3溶液，再分别加入200μL的ANTS衍生化试剂，涡旋，混匀；37℃恒温反应15h后，将三种产物用氮气吹干，溶于1mL6mol/L的尿素溶液，制成三糖标准品、二糖标准品及多糖酸水解产物的衍生化样品，其中三糖标准品和二糖标准品的衍生化样品用6mol/L的尿素溶液分别稀释成不少于6个浓度梯度的衍生化样品；

6)衍生化样品电泳分析：取步骤5)中多糖酸水解产物衍生化样品、三糖标准品衍生化样品和二糖标准品衍生化样品，采用垂直板凝胶电泳分离每个衍生化样品，分离胶为浓度为30％的聚丙烯酰胺凝胶，浓缩胶为浓度为8％的聚丙烯酰胺凝胶，电泳缓冲液为pH8.0-9.0、浓度0.1-0.2mol/L的Tris-boric，上样量为1-3μL，凝胶在UV300nm条件下成像，获得多糖酸水解产物衍生化样品、三糖标准品衍生化样品和二糖标准品衍生化样品的电泳图；

7)绘制三糖标准品和二糖标准品的标准曲线：将多糖酸水解产物衍生化样品、三糖标准品衍生化样品和二糖标准品衍生化样品的电泳图导入Quantity One软件，经过处理后，得到多糖酸水解产物及三糖标准品和二糖标准品的光密度值，以三糖标准品和二糖标准品的光密度值为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线；

8)蒙古黄芪和膜荚黄芪的鉴别：将多糖酸水解产物的光密度值带入步骤7)中的标准曲线，计算黄芪多糖中三糖和二糖的含量，并根据以下标准鉴别蒙古黄芪和膜荚黄芪：

当二糖含量＜1.0mg/mL，且二糖含量/三糖含量＜0.3时，为蒙古黄芪；

当二糖含量＞1.0mg/mL，且二糖含量/三糖含量＞0.3时，为膜荚黄芪。

2.根据权利要求1所述的一种鉴别蒙古黄芪和膜荚黄芪的方法，其特征在于：步骤2)中所述黄芪细粉与水的质量比为1:100。

3.根据权利要求1所述的一种鉴别蒙古黄芪和膜荚黄芪的方法，其特征在于：步骤2)中所述残渣与水的质量比为1:80。

4.根据权利要求1所述的一种鉴别蒙古黄芪和膜荚黄芪的方法，其特征在于：步骤6)中分离胶和浓缩胶的配制溶剂为pH8.0～9.0、浓度0.1～0.2mol/L的Tris-boric缓冲液。

5.根据权利要求1所述的一种鉴别蒙古黄芪和膜荚黄芪的方法，其特征在于：步骤6)中的电泳分离过程分两步进行，首先采用60-80V的分离电压电泳分离40-60min，随后采用100-200V的分离电压电泳分离100-120min。