[发明专利]一种鉴别蒙古黄芪和膜荚黄芪的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种鉴别蒙古黄芪和膜荚黄芪的方法，具体属于荧光辅助凝胶电泳技术，以黄芪多糖部分酸水解后差异性糖片段的含量为鉴定依据的蒙古黄芪和膜荚黄芪的鉴别方法。

背景技术

黄芪，古名黄耆，素有“补益之长”的美誉，收载于历版的《中国药典》，是豆植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根，具有补气固表，利尿托毒，敛疮生肌等功效，有“十药九芪”之说，备受历代中医的青睐。且以黄芪为原料的中成药多达200余种国内市场对黄芪的需求极大，其中约有50％用于生产黄芪饮片，近50％用于中成药和提取物及制剂。

蒙古黄芪和膜荚黄芪因其化学成分有差异而导致其药效有所不同，虽然在植物地上部分形态特征和生物学特征方面也有明显区别，但其药用部分黄芪根外形比较相近，肉眼难以区别。因此，近年来药材市场上出现了两种黄芪混杂现象，扰乱了中药材市场。

临床研究表明，糖类成分是黄芪发挥免疫调节作用的主要物质。将糖类成分作为黄芪质量控制与品质评价的标准，具有良好的研究前景和意义。国内外学者也尝试以总多糖含量对不同种属的黄芪进行比较，然而，所测定的指标缺乏黄芪种属的专属性特征，难以用于黄芪种属的鉴别。

发明内容

本发明的目的是解决现有的蒙古黄芪和膜荚黄芪鉴别方法专属性低、难以鉴别黄芪种属的技术问题，提供一种鉴别蒙古黄芪和膜荚黄芪的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种鉴别蒙古黄芪和膜荚黄芪的方法，包括如下步骤：

1)原料预处理：将干燥的黄芪粉碎成粉末后过100目筛得到黄芪细粉，备用；

2)提取粗多糖：取上述黄芪细粉加水后在100℃的温度下回流提取1h，降至室温后离心取上清液；残渣再加水重复提取1次，取上清，合并上清液；浓缩，将合并的上清液用95％的乙醇调节至含醇量为80％，3000r/min离心10min，合并沉淀，冷冻干燥得多糖粗粉；

3)纯化多糖：将步骤2)得到的多糖粗粉溶于水中，得到多糖粗粉溶液，所述多糖粗粉与水的质量比为1:200，向多糖粗粉溶液中加入浓度为10.6％的亚铁氰化钾溶液和浓度为21.9％的乙酸锌溶液，所述浓度为10.6％的亚铁氰化钾溶液和浓度为21.9％的乙酸锌溶液的加入量均为多糖粗粉溶液体积的10％，振摇后静置30min，离心得到纯化多糖，冻干，备用；

4)多糖酸水解：取步骤3)得到的纯化多糖10mg，加入0.5mol/L三氟乙酸500μL，混匀，随后将混合液置于90℃保温1h，反应结束后，用氮吹干燥仪干燥多糖酸水解产物，然后加入适量甲醇清洗水解产物，继续氮气吹干；

5)多糖酸水解产物、三糖标准品和二糖标准品的衍生化：取三糖标准品6mg、二糖标准品2mg以及步骤4)中得到的多糖酸水解产物，分别加入200μL的NaCNBH3溶液，再分别加入200μL的ANTS衍生化试剂，涡旋，混匀；37℃恒温反应15h后，将三种产物用氮气吹干，溶于1mL6mol/L的尿素溶液，制成三糖标准品、二糖标准品及多糖酸水解产物的衍生化样品，其中三糖标准品和二糖标准品的衍生化样品用6mol/L的尿素溶液分别稀释成不少于6个浓度梯度的衍生化样品；

6)衍生化样品电泳分析：取步骤5)中多糖酸水解产物衍生化样品、三糖标准品衍生化样品和二糖标准品衍生化样品，采用垂直板凝胶电泳分离每个衍生化样品，分离胶为浓度为30％的聚丙烯酰胺凝胶，浓缩胶为浓度为8％的聚丙烯酰胺凝胶，电泳缓冲液为pH8.0-9.0、浓度0.1-0.2mol/L的Tris-boric，上样量为1-3μL，凝胶在UV300nm条件下成像，获得多糖酸水解产物衍生化样品、三糖标准品衍生化样品和二糖标准品衍生化样品的电泳图；

7)绘制三糖标准品和二糖标准品的标准曲线：将多糖酸水解产物衍生化样品、三糖标准品衍生化样品和二糖标准品衍生化样品的电泳图导入Quantity One软件，经过处理后，得到多糖酸水解产物及三糖标准品和二糖标准品的光密度值，以三糖标准品和二糖标准品的光密度值为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线；

8)蒙古黄芪和膜荚黄芪的鉴别：将多糖酸水解产物的光密度值带入步骤7)中的标准曲线，计算黄芪多糖中三糖和二糖的含量，并根据以下标准鉴别蒙古黄芪和膜荚黄芪：

当二糖含量＜1.0mg/mL，且二糖含量/三糖含量＜0.3时，为蒙古黄芪；

当二糖含量＞1.0mg/mL，且二糖含量/三糖含量＞0.3时，为膜荚黄芪。

进一步地，步骤2)中所述黄芪细粉与水的质量比为1:100。