[发明专利]一种利用烟草质体高效生产虾青素的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，涉及一种利用烟草质体高效生产虾青素的方法。

背景技术

虾青素(astaxanthin)是一种酮式类胡萝卜素，即3,3′-二羟基-4,4′-二酮基-β,β′-胡萝卜素，有极强的猝灭单线态氧和清除自由基能力，其抗氧化能力比维生素E强500倍。相比于其他普通的抗氧化物质而言，虾青素可以通过血脑屏障进而发挥更好的抗氧化作用。许多研究指出，虾青素被用来预防糖尿病、心血管疾病、神经系统疾病等，对人类和动物健康有促进作用。如今，虾青素已被制成保健品，也可以作为食用色素，畜牧业和水产品的饲料添加剂，得到较为广泛的应用。

雨生红球藻中虾青素含量为1.5％～3.0％，是目前所知的自然界中含虾青素最多的生物。然而，雨生红球藻生长慢，对生长环境比较敏感，不能大规模低成本养殖。虽然关于雨生红球藻培养虾青素以及虾青素的不同制备方法的研究在国内已较为充分，但是还未形成规模化生产，这也造成了天然虾青素价格高昂和供不应求。目前只有湖北荆州天然虾青素公司初具规模，该公司是亚洲第一家从事规模化养殖雨生红球藻生产天然虾青素的企业。

近年来，不断有科研人员尝试将雨生红球藻等微生物虾青素合成途径中关键酶基因在大肠杆菌、酵母及植物中表达，并取得了一定的成功。其中，烟草质体基因组转化表达细菌来源的CrtW和CrtZ的烟草虾青素含量达到5.44mg/g干重(Hasunuma et al.,Plant J 2008,55:8527-868)。番茄中共表达来源于莱茵衣藻的β-胡萝卜素加氧酶基因(BKT)和来源于雨生红球藻的β-胡萝卜素羟化酶基因(BHY)，叶片中游离的虾青素为3.12mg/g干重，果实中虾青素脂含量为16.1mg/g干重(Huang et al.,Metab Eng 2013,17:59-67)。与烟草相比，虽然果实中虾青素含量较高，但番茄果实较长的生长周期使其总原材料不一定占绝对优势。

发明内容

本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一种利用烟草质体高效生产虾青素的方法。

一种利用烟草质体高效生产虾青素的方法，包括以下步骤：

植物表达载体pAXT，通过合成经密码子优化过的来自水仙(Narcissus pseudonarcissus)的番茄红素-β-环化酶基因(NpLyc)、Brevundimonas sp.SD212菌株的β-胡萝卜素羟化酶(BsCrtZ)基因及β-胡萝卜素酮酶(BsCrtW)基因，共同连接到质体表达载体，组成三顺反子结构，由PrrnT7g10启动子驱动。

进一步，所述的植物表达载体pAXT是通过一下方法构建而得：

合成经密码子优化过的源于Brevundimonas sp.strain SD212菌的BsCrtW和BsCrtZ基因的双顺反子结构，BsCrtW前融合了来自噬菌体T7的g10基因SD序列，BsCrtZ前融合人工合成SD序列(GGGAGGGATTTC)，且BsCrtW和BsCrtZ阅读框之间用BamHI和PstI酶切位点隔开。

将带有IEE(基因间调控元件)的烟草rps16基因的3’UTR(Nt-Trps16)，然后插入到pBluescriptKS载体的SacII/NotI位点间。然后将BsCrtW/BsCrtZ双顺反子用NotI/SalI双酶切后插入到Nt-Trps16-IEE后面。

将带有IEE的烟草rbcL基因的3’UTR(Nt-TrbcL)，然后用BamHI/PstI双酶切后插入到BsCrtW后面。

将莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)rbcL基因的3’UTR(Cr-TrbcL)克隆到SalI/XhoI位点之间。

合成密码子优化过的源于水仙花的NpLyc基因，且NpLyc前面融合了烟草核糖体RNA启动子(Nt-Prrn)及噬菌体T7g10基因的5’UTR，然后将该片段插入到SacI/SacII位点间得到三顺反子结构。

将三顺反子用SacI/XhoI双酶切后插入到pKP9载体(Zhou et al.,2008 Plant Biotechnol J6:897-913)得到pAXT载体。

应用本发明的植物表达载体pAXT建立产虾青素转基因植物的方法，包括构建含有NpLyc、BsCrtW和BsCrtZ的烟草质体表达载体，然后用基因枪的方法得到转基因植株，催化植物本身的类胡萝卜素生成虾青素的转基因植株步骤。