[发明专利]高效表达抗菌肽PG‑1的方法及其在修复组织损伤中的应用

权利要求书

1.一种高效表达抗菌肽PG-1的方法，其包括如下步骤：

(1)提供抗菌肽PG-1的优化后的基因序列SEQ ID NO.1；

(2)构建酵母细胞中表达PG-1的重组质粒pJ912-PG-1；

(3)用所述重组质粒pJ912-PG-1转化毕赤酵母X-33细胞；

(4)筛选阳性转化子，鉴定；

(5)培养转化菌，获得大量表达的抗菌肽PG-1。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，在整个基因序列前后分别加入XhoI_和Not I酶切位点。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，重组质粒的构建是采用限制性内切酶Xho I酶和Not I酶酶切，再用T4DNA连接酶连接而成。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，重组质粒转化方法是电转化法，采用Bio-rad电转化仪预设PIC程序。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，先用SacⅠ酶切重组表达质粒使其线性化，再电击转化毕赤酵母感受态细胞X-33。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中，鉴定阳性转转化子方法为PCR鉴定法。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)中培养转化菌采用的培养基为BMGY培养基，培养条件为30℃、250r/min，培养至OD600＝2-6后离心收集菌体，并重悬于BMMY培养基中进行诱导表达，在摇床上继续培养，培养条件为：30℃，250rpm培养72h，每24h向培养基中添加体积浓度为0.5％的无水甲醇，培养72小时后，10000rpm离心20min，收集培养细胞。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述BMGY培养基的配方为：质量百分比为1％的酵母提取物，2％的蛋白胨，100mmol/L磷酸钾缓冲液，1.4％的酵母氮碱基，0.4μg/mL的维生素H，1％的甘油，其余为ddH₂O，所述100mmol/L磷酸钾缓冲液在加入之前调pH至6.0。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述BMMY培养基的配方为：质量百分比为1％的酵母提取物，2％的蛋白胨，100mmol/L磷酸钾缓冲液，1.4％的酵母氮碱基，体积浓度0.5％的无水甲醇，其余为ddH₂O，所述100mmol/L磷酸钾缓冲液在加入之前调pH至6.0。

10.抗菌肽PG-1在制备用于治疗修复组织损伤的药物中的应用。