[发明专利]高效表达抗菌肽PG‑1的方法及其在修复组织损伤中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及抗菌肽PG-1在酵母菌中的高效表达及其在修复组织损伤中的应用。

背景技术

抗菌肽Protegrin-1(PG-1)是从猪白细胞中分离得到的由18个氨基酸残基组成的猪源抗菌肽，二级结构为β-折叠，4个半胱氨酸形成2个二硫键对其二级结构的维持及抗微生物学活性起着非常重要的作用。目前已证明PG-1对革兰氏阴性菌、部分革兰氏阳性菌、真菌以及少数囊膜病毒有抗微生物学活性，其中包括HIV、登革热病毒。抗菌肽在医学和农业上具有重要的研究和应用价值。因此，PG-1是目前被证明为最具潜力成为抗生素的替代物之一。

酵母表达系统具有生长快、操作简单，利于大规模发酵生产等优点，同时真核生物能对表达外源蛋白质进行翻译后修饰，使得表达的蛋白具有生物学活性等的优点。毕赤酵母是一种可高效表达外源蛋白的表达系统，具有遗传稳定性。毕赤酵母的醇氧化酶(AOX)基因的启动子具有强诱导性和强启动性，适于外源基因的高水平诱导表达，可高密度发酵等许多优点，应用十分广泛，已有数百种外源蛋白在该系统中获得表达。

研究发现，毕赤酵母具有以下特点：遗传背景清楚，易操作；毕赤酵母与日常生活密切、安全、无毒素，对生物和环境不会构成威胁；可进行蛋白翻译后加工；可进行分泌表达，易于纯化；工艺简单成本较低。

以往提取抗菌肽的方法总共有两种：一是直接从蜜蜂体内通过化学的方法提取，这种方法会引入毒性的化学试剂，并且产量低，这种方法经常会用在科学研究中，而不适合大规模生产，还有一种方法是利用已经比较成熟的链霉菌、大肠杆菌和乳酸乳球菌等原核细菌表达系统去表达，但是，抗菌肽对原核细胞具有杀灭的作用，这种现象导致其发酵过程很难顺利完成，产量也比较低，所以，这种方法也很难实现大规模的生产。

损伤组织的修复和愈合大致可分为三个阶段：炎症反应，溶解、清除坏死组织和渗出物。结缔组织细胞和血管内皮细胞游动、增殖、形成肉芽组织。新生结缔组织基质沉积和新生组织改建。组织损伤常常为病原的侵入打开了窗口，感染后过度的炎症反应又可能影响损伤组织的修复。

发明内容

本发明旨在针对以上所提出的现有技术的不足，提供一种利用毕赤酵母高效分泌表达抗菌肽PG-1的方法，利用该方法可以实现PG-1的规模化生产。

为此，本发明提供了如下技术方案。

一种高效表达抗菌肽PG-1的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)提供抗菌肽PG-1的优化后的基因序列；

(2)构建酵母细胞中表达PG-1的重组质粒pJ912-PG-1；

(3)用所述重组质粒pJ912-PG-1转化毕赤酵母X-33细胞；

(4)筛选阳性转化子，鉴定；

(5)培养转化菌，获得大量表达的抗菌肽PG-1。

进一步地，步骤(1)中，在整个基因序列前后分别加入XhoI_和NotI酶切位点。

进一步地，步骤(2)中，重组质粒的构建是采用限制性内切酶Xho I酶和Not I酶酶切，再用T4 DNA连接酶连接而成。

进一步地，步骤(3)中，重组质粒转化方法是电转化法，采用Bio-rad电转化仪预设PIC程序。

进一步地，步骤(3)中，先用SacⅠ酶切重组表达质粒使其线性化，再电击转化毕赤酵母感受态细胞X-33。

更进一步地，电击转化的条件为：电压1.5kv，电击4ms。电击优选一律在冰上进行。电击完毕后，放置于0℃预冷过的1M的山梨醇溶液中。

进一步地，步骤(4)中，鉴定阳性转转化子方法为PCR鉴定法。

优选地，PCR扩增引物为：正向：5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’(SEQ ID NO.2)，反向：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’(SEQ ID NO.3)。PCR反应程序为：①94℃1min；②94℃30min，55℃30min，72℃1min，35个循环；72℃10min电泳结束后取5μL样用1％琼脂糖凝胶电泳检测。

进一步地，步骤(5)中培养转化菌采用的培养基为BMGY培养基。培养条件为30℃、250r/min，培养至OD600＝2-6后离心收集菌体，并重悬于BMMY培养基中进行诱导表达，在摇床上继续培养，培养条件为：30℃，250rpm培养72h，每24h向培养基中添加体积浓度为0.5％的无水甲醇，培养72小时后，10000rpm离心20min，收集培养细胞。