[发明专利]一种神经细胞无血清培养基及其应用

权利要求书

1.一种神经细胞无血清培养基，其特征在于，由以下成分组成：

基础培养基DMEM；

生长因子：碱性成纤维生长因子，终浓度：0.1-10μg/ml；表皮生长因子，终浓度：0.1-10μg/ml；血管内皮生长因子，终浓度：0.1-10μg/ml；脑源性神经营养因子，终浓度：0.01-1μg/ml；

蛋白质：牛血清白蛋白，终浓度：0.001-0.1％；转铁蛋白，终浓度10-500μg/ml；

激素：胰岛素，终浓度：1-100μg/ml；类胰岛素生长因子1，终浓度：0.1-10μg/ml；皮质酮，终浓度：1-100μg/ml；黄体酮，终浓度：0.1-10μg/ml；

其它物质：大豆胰蛋白酶抑制剂，终浓度：0.1-20μg/ml；丁二胺，终浓度：1-100μg/ml；亚硒酸钠，终浓度：1-1000μg/ml；

所述的神经细胞无血清培养基的pH值调节至7.4。

2.一种如权利要求1所述的神经细胞无血清培养基的配制方法，其特征在于，每100ml神经细胞无血清培养基配制方法如下，其他体积的培养基按比例放大或缩小进行配制：

取90ml的DMEM培养液；

按照优化的最适浓度依次加入上述血清替代物中的各成分；

用氢氧化钠调节pH值到7.4；

补加DMEM至100ml；

用0.22μm的除菌过滤器将溶液过滤，于4℃保存备用。

3.一种如权利要求1所述的神经细胞无血清培养基的应用，其特征在于，所述的神经细胞无血清培养基配合神经细胞有血清培养基共同使用，进行神经细胞的培养。

4.根据权利要求3所述的神经细胞无血清培养基的应用，其特征在于，每100ml神经细胞有血清培养基通过以下方式配制得到，其他体积的培养基按比例放大或缩小进行配制：

无菌取84mlDMEM培养基；

无菌加入10ml胎牛血清，加入5ml马血清，1ml浓度为10mg/ml的谷氨酰胺；

保存于4℃环境下备用。

5.根据权利要求4所述的神经细胞无血清培养基的应用，其特征在于，所述的神经细胞无血清培养基配合神经细胞有血清培养基共同使用，进行大鼠海马神经元细胞贴壁培养，具体步骤如下：

取15-20天的SD大鼠，用常规方法无菌取出双侧海马，剪碎，置于0.125wt％的胰蛋白酶/EDTA消化液中，于37℃，5vol％CO₂，消化20-30分钟；

将上述消化组织无菌转至无菌离心管中，加入3ml神经细胞有血清培养基，然后吹打，以分散组织成单个细胞，得到细胞悬液；

用血球计数板计数上述细胞悬液，调整细胞浓度至4～6×10⁵细胞/ml；

接种细胞至6孔培养板中，1.5ml/孔，于37℃，5％CO₂培养箱中培养24小时；

第二天，分别在不同的孔中更换神经细胞有血清培养基或神经细胞无血清培养基，继续培养7天，其间分别换液2次；

第7天后，在神经细胞有血清培养基的孔中加入细胞分裂抑制剂，继续培养，每周换液2次，细胞分裂抑制剂为含有20ug/ml的脱氧尿苷与40ug/ml的尿苷；

在神经细胞无血清培养基的孔中不加入细胞分裂抑制剂，继续培养，每周换液2次。

6.根据权利要求4所述的神经细胞无血清培养基的应用，其特征在于，所述的神经细胞无血清培养基配合神经细胞有血清培养基共同使用，进行大鼠皮层神经细胞贴壁培养，具体步骤如下：

取新生的SD大鼠，用常规方法无菌取出脑皮层，剥去脑膜，剪碎，置于0.125％的胰蛋白酶/EDTA消化液中，于37℃，5％CO₂，消化20-30分钟；

将上述消化组织无菌转至无菌离心管中，加入3ml神经细胞有血清培养基，然后吹打，以分散组织成单个细胞，得到细胞悬液，然后用200目的无菌筛网过滤细胞悬液至另一个离心管中；

用血球计数板计数上述细胞悬液，调整细胞浓度至2～4×10⁵细胞/ml；

接种细胞至6孔培养板中，1.5ml/孔，于37℃，5％CO₂培养箱中培养24小时；

第二天，分别在不同的孔中更换神经细胞有血清培养基或神经细胞无血清培养基，继续培养4天，其间分别换液2次；

第4天后，在神经细胞有血清培养基的孔中加入细胞分裂抑制剂，继续培养，每周换液2次，细胞分裂抑制剂为含有20ug/ml的脱氧尿苷与40ug/ml的尿苷；

在神经细胞无血清培养基的孔中不加入细胞分裂抑制剂，继续培养，每周换液2次。