[发明专利]一种控制大肠杆菌中质粒复制的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种控制大肠杆菌中质粒复制的方法。

技术背景

质粒是细胞中染色体以外，能够独立自主复制的较小的DNA分子。其长度从数千乃至几百万碱基不等。其拷贝数也能从几个到上千个不等。天然存在的质粒分子，通常对宿主细胞的生存没有决定性的作用，但是能够携带一些特殊的基因，比如抗生素抗性基因，致病调控基因等，增加宿主细胞的遗传与生理多样性。鉴于这些特点，在20世纪70年代前后，质粒DNA被开发成为有效的基因工程载体，用以携带外源基因到特定的宿主，进行基因克隆以及外源蛋白表达。

大肠杆菌(Escherichia coli)是一种革兰氏阴性短杆菌，是人和动物肠道中最主要的栖居菌之一。实验室培养的大肠杆菌通常30min能够复制一代。其基因组长度为～4.7Mb,包含大约4000个基因。由于其结构简单，培养方式简单，生长迅速，遗传背景清晰，目前已经作为模式微生物，被广泛的应用于基因工程，分子生物学，代谢工程以及合成生物学相关的研究以及工业应用中。

目前，实验室和工业应用构建的～90％以上的质粒是在大肠杆菌中进行克隆复制或者生产的。这其中包括用于表达抗原分子的DNA疫苗；用于微生物，植物，动物蛋白表达和功能研究的质粒；用于微生物，植物，动物基因编辑以及转录控制的质粒以及用于自然界生物基因库保存的质粒等。质粒在大肠杆菌中的复制状态以及拷贝数等对于利用质粒进行功能研究以及工业应用具有重要的意义。比如，通过控制质粒的复制，调控质粒上基因的表达，对于研究质粒上单基因或多基因的表达，利用质粒进行合成生物学和分子生物学的研究具有重要价值。同时，控制质粒的复制能够有效的解决毒性基因克隆或表达困难的问题。一些DNA序列，其在大肠杆菌中随机或者定向转录出来的mRNA或者翻译出来的蛋白质能够对大肠杆菌的生长造成很大的干扰。这类基因被称为毒性基因。这些毒性基因在克隆进一些特定的载体比如哺乳动物表达载体pCDNA3.1以及大肠杆菌克隆载体pUC57的时候，由于这些载体的拷贝数比较高，使得这些外源基因的mRNA转录物以及蛋白表达产物对大肠杆菌生长干扰极大的增强，造成大肠杆菌死亡或者生长停滞。控制质粒的复制，使得质粒在大肠杆菌中复制的时候能够维持在一个较低的水平，是在构建毒性基因克隆表达质粒过程中常用的一种策略。

目前，基因工程和工业应用的，绝大多数构建的质粒为ColEI类型的质粒；代表性的ColE1质粒,比如pUC，pET，p15A以及pMB1系列质粒。ColEI类型的质粒的复制依赖于复制区转录的两个小RNA，RNAI以及RNAII。RNAII全长555bp。在质粒复制开始的时候，它首先被宿主的RNA聚合酶从其启动子区转录出来，并与质粒DNA模板形成复合物。接下来，其被宿主体内的RNAase H切割，产生游离的3’羟基端，并作为引物被DNA聚合酶I识别，引导质粒的复制。RNAI全长108bp，在ColEI的复制中起着负调控的作用。它从复制起点上游的455bp处(RNAII的中间)，以RNAII相反的方向转录，一直延伸到RNAII的5’转录起始区。它通过与RNAII的结合，阻止RNAII和DNA复制起始复合物的形成来抑制质粒的复制。RNAII对复制起始的正向作用和RNAI对复制起始的负向作用的平衡决定了质粒复制的拷贝数(Solar et al.1998Microbiol Mol Biol Rev；Tomizawa J.1984Cell；Camps M.2010,Recent Pat DNA GeneSeq)。

专利US 7,794,971 B1在大肠杆菌中利用诱导型的启动子表达了一个聚合酶基因pcnb的突变体，通过影响RNAI的多腺苷酸化，从而影响质粒的复制。PCNB聚合酶能够决定RNAI的多腺苷酸化，从而影响RNAI的降解以及与RNAII的复合物形成。pcnb突变体，能够大量积累RNAI的半衰产物。这些产物与RNAII的结合，从而抑制质粒的复制。该专利所述的菌株，同时被Epicentre公司(USA)开发成了商业化的感受态，对外售卖。据报道，在不诱导的情况下，其能针对性的降低CorE1类型的质粒，比如pET28a，pUC57等拷贝数4～20倍。同时，专利US 20110269184 A1利用一个诱导型的启动子在基因组上转录RNAI或RNAII，来实现CorE1类型质粒复制调控的目的。据其专利所述，其能够将pUC19质粒在细胞中的量降低10％，能够将去除RNAI序列的pUC19在细胞中的产量降低3倍左右。