[发明专利]一种利用番茄斑萎病毒NSm基因鉴定烟草抗性的方法

权利要求书

1.一种利用番茄斑萎病毒NSm基因鉴定烟草抗性的方法，其特征在于，包括如下步骤：

鉴定出番茄斑萎病毒基因组中激发含有抗性位点RTSW的烟草产生抗病反应的无毒基因，该无毒基因是NSm基因，核苷酸序列如SEQ ID No.1 所示；

用所述番茄斑萎病毒基因组中的所述无毒基因构建系列的鉴别菌株；

将带有所述无毒基因NSm的农杆菌悬液注渗到烟草应试寄主叶片脉间，并检测所述烟草应试寄主的过敏反应。

2.根据权利要求1所述的利用番茄斑萎病毒NSm基因鉴定烟草抗性的方法，其特征在于，若在所述应试寄主上检测到所述过敏反应，则表明所述应试寄主对所述无毒基因发生了识别作用，提示所述寄主具有针对该无毒基因的抗病基因。

3.根据权利要求1所述的利用番茄斑萎病毒NSm基因鉴定烟草抗性的方法，其特征在于，所述鉴定出番茄斑萎病毒基因组中激发含有抗性位点RTSW的烟草产生抗病反应的无毒基因，具体包括：在所述番茄斑萎病毒基因组中搜索已注释的病毒功能基因，并从病毒的功能基因中验证出特异针对RTSW抗性位点的无毒基因。

4.根据权利要求1或2所述的利用番茄斑萎病毒NSm基因鉴定烟草抗性的方法，其特征在于，用所述番茄斑萎病毒基因组中的所述无毒基因构建系列的鉴别菌株，具体包括：

克隆所述无毒基因NSm全长序列作为候选基因，并将所述候选基因克隆于表达双元载体pK2GW7中，构建含有所述无毒基因NSm的表达载体；

通过农杆菌注渗法分别将含有所述无毒基因NSm的表达载体导入根癌农杆菌EHA105菌株中，构建所述系列的鉴别菌株。

5.根据权利要求4所述的利用番茄斑萎病毒NSm基因鉴定烟草抗性的方法，其特征在于，将带有所述无毒基因NSm的农杆菌悬液注渗到烟草应试寄主叶片脉间，具体包括：

将包含无毒基因NSm的农杆菌在根癌农杆菌培养基LB中，于28℃培养24小时，离心收集菌体，再用浸润缓冲液稀释成OD600＝0.5的菌体悬液；

用无菌的去掉针头的注射器，将菌体悬液9.5-10.5微升，从烟草植株的叶背注渗入叶脉间，形成一个可见的浸润斑；将接种后的烟草植株置于20-28℃及80％湿度的环境中，交替进行连续光照16小时及连续黑暗8小时，共观察72小时。

6.根据权利要求5所述的利用番茄斑萎病毒NSm基因鉴定烟草抗性的方法，其特征在于，检测所述应试寄主的过敏反应，具体包括：

在所述烟草寄主上以含有pK2-35S-NSm+p2300-35S-Sw-5b的EHA105菌株作阳性对照，以含有pK2-35S-NSs的EHA105菌株为阴性对照，观察若所述烟草应试寄主上产生含无毒基因NSm表达载体的鉴别菌株诱导的过敏反应，则确认所述烟草应试寄主相对所述无毒基因NSm的抗病品种。