[发明专利]用于表达红色荧光蛋白的无乳链球菌质粒及其构建方法和应用

权利要求书

1.用于表达红色荧光蛋白的无乳链球菌质粒，其特征在于，所述用于表达红色荧光蛋白的无乳链球菌质粒为pBCH-RM质粒，所述pBCH-RM质粒的序列号为SEQ ID No.1。

2.权利要求1所述用于表达红色荧光蛋白的无乳链球菌质粒的构建方法，其特征在于，具体步骤为：

(1)启动子PrecA的制备：

以鱼源无乳链球菌基因组为模板，引物为PrecA-F和PrecA-R，PCR扩增后通过凝胶电泳，回收目的片段即得启动子PrecA片段；其中，

PrecA-F：

CAGGCTAGCGGTATCGGTTTAACGGGAGTTGCTG

PrecA-R：

TCGCTCACCTAAGCGCATCACTG；

(2)制备红色荧光蛋白基因mcherry片段：

以pmCherry-C1质粒为模板，引物：Pmche-F和Pmche-R；PCR扩增后通过凝胶电泳，回收目的片段即得红色荧光蛋白基因mcherry片段；其中，

Pmche-F：

AGTGATGCGCTTAGGTGAGCGAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGAT

Pmche-R：

GAAGATCTCTACTTGTACAGCTCGTCCATG；

(3)启动子PrecA与红色荧光蛋白基因mcherry连接：

将步骤(1)中回收的启动子PrecA与步骤(2)中回收的红色荧光蛋白基因mcherry片段按照1：1进行混合作为模板；通过引物PrecA-F和Pmche-R进行overlap PCR，得到PCR产物PrecA-mcherry；

(4)PCR产物的连接、纯化、转化与鉴定：

A.将步骤(3)纯化的PCR产物PrecA-mcherry与pBCH载体进行连接过夜，得到连接产物，通过胶回收试剂盒对连接产物进行回收，并使用双蒸水洗脱连接产物；

B.回收的连接产物加入无乳链球菌感受态细胞中，混匀后加入预冷的电击杯中，静置后进行电转，加入无菌的脑心浸液培养，得到悬浮菌体；

C.将所得悬浮菌体，转入至无菌的EP管中，摇床培养，收集菌体，涂布于含有四环素抗性的BHI平板，静置培养观察菌落，有红色荧光的菌落即为阳性，经过PCR验证并进行测序，鉴定得到所述用于表达红色荧光蛋白的无乳链球菌的质粒pBCH-RM。

3.如权利要求2所述的用于表达红色荧光蛋白的无乳链球菌质粒的构建方法，其特征在于，

所述(4)PCR产物的连接、纯化、转化与鉴定中：

将步骤(3)中纯化的PCR产物PrecA-mcherry与pBCH载体分别进行NheI和BglII双酶切，分别回收酶切产物；回收后的酶切产物通过T4 DNA连接酶进行连接，然后使用胶回收试剂盒纯化连接产物，转化无乳链球菌感受态细胞，涂布四环素抗性平板，28℃培养2天，筛选有红色荧光的菌落；根据PCR扩增及其产物测序、菌落荧光对阳性菌落进行鉴定，鉴定得到所述用于表达红色荧光蛋白的无乳链球菌质粒pBCH-RM。

4.如权利要求3所述的用于表达红色荧光蛋白的无乳链球菌质粒的构建方法，其特征在于，所述启动子PrecA制备的反应体系为：5×buffer 10μL，dNTPs 4μL，引物PrecA-F 1μL，引物PrecA-R 1μL，DNA模板1μL，ExTaq酶1μL，补H₂O至50μL。

5.如权利要求4所述的用于表达红色荧光蛋白的无乳链球菌质粒的构建方法，其特征在于，所述启动子PrecA与红色荧光蛋白基因mcherry连接的overlap PCR反应体系为：5×buffer 10μL，dNTPs 4μL，引物PrecA-F 1μL，引物Pmche-R 1μL，PrecA模板1μL，mcherry模板1μL，ExTaq酶1μL，补H₂O至50μL。

6.如权利要求2所述的用于表达红色荧光蛋白的无乳链球菌质粒的构建方法，其特征在于，所述启动子PrecA片段，序列号为SEQ ID No.2。