[发明专利]用于表达红色荧光蛋白的无乳链球菌质粒及其构建方法和应用

说明书

本发明属于生物监测技术领域，特别涉及一种用于表达红色荧光蛋白的无乳链球菌质粒及其构建方法和应用；本发明将鱼源无乳链球菌recA基因的启动子通过overlap PCR的方法融合至mcherry基因的上游，然后将此融合片段连接至pBCH载体上，即为pBCH‑RM质粒。通过将pBCH‑RM质粒应用到鱼源无乳链球菌菌株上，使其能够高效且稳定表达红色荧光蛋白，而且其保留了亲本菌株的强毒性生物学特征，能够应用于无乳链球菌的传播途径、荧光示踪和病原与宿主相互作用等基础研究。

技术领域

本发明属于生物监测技术领域，特别涉及一种用于表达红色荧光蛋白的无乳链球菌质粒及其构建方法和应用。

背景技术

罗非鱼(Tilapia)作为淡水优良养殖品种之一，在我国南方如广东、广西和海南等地区已大规模人工养殖，据农业部渔业局统计数据表明，2015年我国罗非鱼养殖产量约178万t(2016年中国渔业统计年鉴)，总产量居全球第一位。然而，近年来链球菌病严重制约了我国罗非鱼产业的健康可持续发展。自2009年起，我国多个地区的养殖罗非鱼连年暴发链球菌病，其累积死亡率为30％～80％，而且90％以上的临床菌株是无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)。无乳链球菌是鱼类重要的病原菌，可感染多种经济鱼类，如银鲳(Pampus argenteus)、金鲳(Trachinotus blochii)、金头鲷(Sparus auratus)、胭脂鱼(Liza klunzingeri)、尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)、齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti)、鞍带石斑鱼(Epinephelus lanceolatus)和宝石鲈(Scortumbarcoo)等，其中对罗非鱼的危害尤为严重。迄今，世界多个国家和地区养殖的罗非鱼均有感染无乳链球菌的相关报道，如中国、泰国、印度尼西亚、美国、巴西、洪都拉斯、哥伦比亚、哥斯达黎加和厄瓜多尔等。由于我国罗非鱼养殖产量大，因此，链球菌病的危害也最为严重。我国南方地区罗非鱼主养区每年均有大规模的链球菌病暴发，造成的经济损失高达数亿元。

红色荧光蛋白标记的鱼源无乳链球菌，对于无乳链球菌毒力相关基因、浸染过程、致病机制和病原菌与宿主相互作用等研究奠定了基础。然而，目前，国内外尚无鱼源无乳链球菌红色荧光蛋白标记菌株的相关报道，并且也没有可参考的高效表达红色荧光蛋白标记的鱼源无乳链球菌的方法。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的之一在于提供了能够在无乳链球菌中高效表达荧光蛋白的强启动子PrecA以及用于表达红色荧光蛋白的无乳链球菌的质粒。本发明的目的之二在于提供了用于表达红色荧光蛋白的无乳链球菌质粒的构建方法。本发明的目的之三在于提供了用于表达红色荧光蛋白的无乳链球菌质粒的应用。

本发明采用如下技术方案实现上述技术问题：

用于表达红色荧光蛋白的无乳链球菌质粒，所述载体为pBCH-RM质粒，所述pBCH-RM质粒的序列号为SEQ ID No.1。

所述用于表达红色荧光蛋白的无乳链球菌质粒的构建方法具体步骤为：

(1)启动子PrecA的制备：

以鱼源无乳链球菌基因组为模板，引物为PrecA-F和PrecA-R，PCR扩增后通过凝胶电泳，回收目的片段即得启动子PrecA片段；启动子PrecA片段，序列号为SEQ ID No.2。其中，

PrecA-F：

CAGGCTAGCGGTATCGGTTTAACGGGAGTTGCTG

PrecA-R：

TCGCTCACCTAAGCGCATCACTG；