[发明专利]一种B细胞筛选方法及其在单克隆抗体制备中的应用

权利要求书

1.一种B细胞筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：

S11、设计上游引物和下游引物，在Protein A蛋白基因的N端加上分泌表达的信号肽序列，在C端加上跨膜蛋白基因序列，将这三段序列相连，以金黄色葡萄菌的DNA为模板，采用所述上游引物和下游引物进行PCR扩增，得到融合外源基因；

S12、将所述融合外源基因与慢病毒载体相连，得到慢病毒表达质粒，所述慢病毒表达质粒与慢病毒辅助质粒共转染已经免疫完成的B细胞，作为待筛选细胞；

S13、向所述待筛选细胞中加入标记荧光的抗原，使用流式细胞仪将带有荧光的细胞分选收集，得到阳性B细胞。

2.根据权利要求1所述的B细胞筛选方法，其特征在于，所述上游引物和下游引物设计如下：

PROTEIN-BAMH I-F:

5’-CCAGGATCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACGCGGCCAATGCTGCGCAACACGATGAA-3’；

PROTEIN-XHOI-R:

5’-CCGCTCGAGTCAGACACAGAAGAAGATGCCTAGCCCAATGAAAAGCAGGAGGCCGGCGACGCCCCCCAGCACAATCAGGGCGCCCCCCAGCACAATCAG-3’。

3.根据权利要求1所述的B细胞筛选方法，其特征在于，取免疫后动物的脾脏，分离得到的脾细胞即为所述已经免疫完成的B细胞。

4.根据权利要求1所述的B细胞筛选方法，其特征在于，所述步骤S13中，分泌表达的Protein A蛋白通过跨膜蛋白挂在细胞膜上，抗体分子同时被Protein A蛋白吸附后被聚集在细胞膜表面，标记荧光的抗原与抗体结合，形成Protein A蛋白+目标抗体分子+抗原的复合体，这种复合体与B细胞相连，由于抗原分子带有荧光信号，采用流式细胞仪的分选收集阳性B细胞。

5.一种B细胞筛选方法在单克隆抗体制备中的应用，其特征在于，将权利要求1至4中任一项筛选得到的阳性B细胞与骨髓瘤细胞融合，用于制备单克隆抗体。

6.一种单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S21、设计上游引物和下游引物，在Protein A蛋白基因的N端加上分泌表达的信号肽序列，在C端加上跨膜蛋白基因序列，将这三段序列相连，以金黄色葡萄菌的DNA为模板，采用所述上游引物和下游引物进行PCR扩增，得到融合外源基因；

S22、将所述融合外源基因与慢病毒载体相连，得到慢病毒表达质粒，所述慢病毒表达质粒与慢病毒辅助质粒共转染已经免疫完成的B细胞，作为待筛选细胞；

S23、向所述待筛选细胞中加入标记荧光的抗原，使用流式细胞仪将带有荧光的细胞分选收集，得到阳性B细胞；

S24、将所述阳性B细胞与骨髓瘤细胞融合，所得杂交瘤细胞用于制备单克隆抗体。

7.根据权利要求6所述的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤S24中，所述阳性B细胞与骨髓瘤细胞融合后，通过稀释法培养得到单克隆细胞株，取其分泌的抗体。