[发明专利]一种B细胞筛选方法及其在单克隆抗体制备中的应用

说明书

本申请涉及一种B细胞筛选方法及其在单克隆抗体制备中的应用。该B细胞筛选方法包括如下步骤：S11、在Protein A蛋白基因的N端加上分泌表达的信号肽序列，在C端加上跨膜蛋白基因序列，得到融合外源基因；S12、将所述融合外源基因转染已经免疫完成的B细胞，作为待筛选细胞；S13、向所述待筛选细胞中加入标记荧光的抗原，使用流式细胞仪将带有荧光的细胞分选收集，得到阳性B细胞。本发明将抗体分子集合在细胞表面，利用流式细胞仪的快速精密的分选功能，提前对待融合细胞进行筛选，大大改进传统方法的成功率，准确率，更是解决后期对单克隆抗体细胞株的检测问题。

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种B细胞筛选方法及其在单克隆抗体制备中的应用。

背景技术

单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤(hybridoma)抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。用具备这种特性的单个杂交瘤细胞培养成细胞群，可制备针对一种抗原表位的特异性抗体即单克隆抗体。杂交瘤细胞的制备是生物学领域中常用的技术手段，常规方法中对融合后的细胞株的检测，鉴定费时费力，成功率不高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于：杂交瘤细胞的制备过程中对融合细胞株的检测费时费力、成功率不高。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为：提供一种B细胞筛选方法，包括如下步骤：

S11、在Protein A蛋白基因的N端加上分泌表达的信号肽序列，在C端加上跨膜蛋白基因序列，得到融合外源基因；

S12、将所述融合外源基因转染已经免疫完成的B细胞，作为待筛选细胞；

S13、向所述待筛选细胞中加入标记荧光的抗原，使用流式细胞仪将带有荧光的细胞分选收集，得到阳性B细胞。

在本发明提供的B细胞筛选方法中，所述步骤S11中，设计上游引物和下游引物，在N端加上分泌表达的信号肽序列，在C端加上跨膜蛋白基因序列，将这三段序列相连，以金黄色葡萄菌的DNA为模板，采用所述上游引物和下游引物进行PCR扩增，得到所述融合外源基因。

在本发明提供的B细胞筛选方法中，所述上游引物和下游引物设计如下：

PROTEIN-BAMH I-F:

5’-CCAGGATCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACGCGGCCAATGCTGCGCAACACGATGAA-3’；

PROTEIN-XHOI-R:

5’-CCGCTCGAGTCAGACACAGAAGAAGATGCCTAGCCCAATGAAAAGCAGGAGGCCGGCGACGCCCCCCAGCACAATCAGGGCGCCCCCCAGCACAATCAG-3’。

在本发明提供的B细胞筛选方法中，所述步骤S12中，将所述融合外源基因与慢病毒载体相连，得到慢病毒表达质粒，转染已经免疫完成的B细胞。

在本发明提供的B细胞筛选方法中，所述慢病毒表达质粒与慢病毒辅助质粒共转染已经免疫完成的B细胞。

在本发明提供的B细胞筛选方法中，取免疫后动物的脾脏，分离得到的脾细胞即为所述已经免疫完成的B细胞。