[发明专利]抗癌、抗炎多肽Lunasin在哺乳动物细胞CHO-S中的表达、纯化方法

权利要求书

1.利用哺乳动物细胞制备Lunasin的方法，其特征在于包含如下步骤：

（1）体外化学合成Lunasin基因；

（2）以体外化学合成的Lunasin基因为模板，设计含有特异性酶切位点的引物，PCR扩增Lunasin基因；

（3）真核细胞表达载体的改造：首先运用内切酶NheI和EcoRI同时双酶切表达载体pcDNA3.1及体外合成的如SEQ ID NO.4所示的小鼠IL2信号肽和6个连续的编码组氨酸的基因序列，然后分别回收两者酶切后的目的片段，纯化后用T4 DNA连接酶于16℃过夜连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取生长良好的单一菌落进行菌落PCR验证；提取阳性克隆的质粒，用内切酶XhoI和ApaI进行双酶切后，用同样的技术手段将SEQ ID NO.7所示的体外合成的强启动子WPRE基因序列连接入多克隆位点，阳性克隆即为改造成功的表达载体pZWCT1;

（4）通过EcoRI和XhoI双酶切和T4 DNA连接酶方法将Lunasin基因连接到改造后的哺乳动物细胞表达载体pZWCT1上；

（5）阳性克隆的鉴定；

（6）表达载体质粒瞬时转染哺乳动物细胞CHO-S；

（7）高密度培养生产Lunasin多肽；

（8）Lunasin多肽的分离纯化。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（2）中所述的含有特异性酶切位点的引物为含有EcoRI和XhoI酶切位点的引物，上游引物序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物序列如SEQ ID NO.3所示。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（5）所述的阳性克隆的鉴定方法为菌落PCR鉴定、双酶切鉴定及测序鉴定中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（7）所述的高密度培养生产Lunasin多肽的方法为在GibcoBRL公司的无血清IMDM培养基中培养，培养条件为在5% CO₂浓度孵箱，37℃，100-150rpm振荡培养10天。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（8）所述的Lunasin多肽的分离纯化方法为：离心后收取上清液，使用镍离子柱亲和纯化Lunasin蛋白，并用SDS-PAGE检测纯化蛋白质的纯度。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于还包括蛋白质免疫印迹分析鉴定Lunasin多肽及Lunasin多肽的生物活性鉴定。