[发明专利]抗癌、抗炎多肽Lunasin在哺乳动物细胞CHO-S中的表达、纯化方法

说明书

本发明公开了抗癌、抗炎多肽Lunasin在哺乳动物细胞CHO‑S中的表达、纯化方法。Lunasin多肽在哺乳动物细胞中的表达、纯化方法，包含如下步骤：(1)体外化学合成Lunasin基因；(2)PCR扩增Lunasin基因；(3)真核细胞表达载体的改造；(4)将Lunasin基因连接到改造后的哺乳动物细胞表达载体pZWCT1上；(5)阳性克隆的鉴定；(6)表达载体质粒瞬时转染哺乳动物细胞CHO‑S；(7)高密度细胞培养生产Lunasin多肽；(8)Lunasin多肽的分离纯化。本发明使Lunasin多肽的规模化生产成为可能，成本低、产量高，蛋白修饰准确，而且蛋白纯化方便简单。

技术领域

本发明属于蛋白质工程领域，涉及抗癌、抗炎多肽Lunasin在哺乳动物细胞CHO-S中的表达、纯化方法。

背景技术

Lunasin多肽是一种最早分离于大豆的富含天冬氨酸(Asp)的活性肽(分子量为5.5KD)，由43个氨基酸组成，序列为SKWQHQQDSCRKQLQGVNLTPCEKHIMEKIQGRGDDDDDDDDD。N端第1-22个氨基酸序列的功能目前尚不清楚，第23-31个氨基酸序列可使Lunasin定位到染色体组蛋白H3和H4上，第32-34氨基酸Arg-Gly-Asp(RGD)是一个细胞黏附基序，可使Lunasin进入细胞核。它的C端连续9个Asp可使Lunasin多肽结合到染色体着丝粒处，使微管不能粘附在着丝粒着丝点上(Hernández-Ledesma et al.2009)。Lunasin多肽的上述性质使其具有显著的抗癌活性。目前研究表明，Lunasin多肽的抗癌机理主要有：Lunasin多肽通过与肿瘤细胞内乙酰化的核心组蛋白特异性结合，抑制核心组蛋白去乙酰化，从而阻断细胞的有丝分裂，最终导致肿瘤细胞的死亡(Hernández-Ledesma et a1.2011)；在肿瘤细胞模型的实验中，Lunasin多肽的抗癌作用不依赖于抑制组蛋白的去乙酰化，而是通过干扰肿瘤细胞的信号通路从而抑制肿瘤细胞的生长(Dia&Mejia,2011；Kapoor,2014)。此外，Lunasin多肽还可以和免疫细胞因子--白细胞介素(IL-12或者IL-2)协同作用，提高杀伤肿瘤细胞的作用(Chang et al.2014)。大量的研究表明，炎症反应是诱发肿瘤发生、形成和发展的一个重要因素。而Lunasin多肽在抗细胞炎症反应中也可以发挥重要的功能。如：Lunasin多肽可以抑制脂多糖(LPS)刺激巨噬细胞RAW 264.7后促炎因子前列腺素2(PGE2)和一氧化氮(NO)的形成，通过抑制NF-κB通路来发挥抗炎症的作用(Dia et al.2009；Mejia&Dia,2009)。最近，Jia等研究发现Lunasin多肽可以通过诱导细胞凋亡抑制类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的增殖，进一步通过抑制细胞内促炎细胞因子(IL-6，IL-8和基质金属蛋白酶)的产生，而发挥抗炎症作用(Jia et al.2015)。Lunasin多肽可抗肠道和血清降解，在抵达靶器官和血液后仍保持活性和完整性。因此，Lunasin多肽在抗癌抗炎症方面具有极大的应用潜力，将在人类健康中发挥重大作用。

目前，Lunasin多肽主要有从天然物质中分离、化学合成、谷类发酵、重组表达的方法。但是从天然物质中分离步骤繁琐、劳动强度大，化学合成则成本昂贵，无法满足后续体内外实验的研究需要。重组的途径则成为大量生产Lunasin多肽的首选方法之一。但目前公开的重组制备Lunasin多肽的方法仅限于大肠杆菌原核表达以及毕赤酵母真核表达。相比于大肠杆菌原核表达系统和毕赤酵母真核表达系统，哺乳动物细胞表达系统发展较晚，而且细胞培养成本高，条件难掌握，易污染，在一定程度上也影响了它的广泛应用。因此，目前尚未见在哺乳动物细胞中重组表达Lunasin多肽的相关报道。