[发明专利]一种工程化心肌组织中心肌细胞去分化重塑的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种心肌细胞，特别涉及一种工程化心肌组织中心肌细胞去分化重塑的方法。

背景技术

近年来心肌组织工程发展迅速，以生物支架材料和种子细胞为基础构建的组织工程化心肌组织技术已越来越成熟。工程化心肌组织具有很大的潜在发展空间。新近研究表明，通过体外组织工程手段构建的心肌组织不仅可以实现心肌细胞的损伤修复，心脏组织的重构等，而且还被认为是体外探讨心肌生理病理问题的良好模型体系。在过去几年中，已有大量文献报道利用生物材料结合种子细胞来模拟天然心肌组织的结构，成功构建出能够节律性收缩的心脏组织，并实现了对心肌细胞功能的调控。然而，在心肌组织的构建中仍然存在许多挑战，且越来越多的研究者认为利用发育生物学原理指导工程化心肌组织的构建对于改善构建的心肌组织质量具有重要意义。

对于组织工程化心肌组织构建的研究，以往研究者大部分把落脚点放在如何构建出与在体组织高度相关的心肌组织模型。近十几年，心脏干细胞作为种子细胞的来源已经吸引了大量的心肌组织工程研究者的关注，且已被证实在修复受损心脏组织中具有很大潜能。而受限于心脏干细胞的数量，当心脏组织受损超过一定程度其修复效果受到限制。近几年研究者将目光集中在是否可以实现工程化心肌组织中终末分化的心肌细胞恢复再生能力的研究上。他们发现使用终末分化心肌细胞可以在体外构建具有节律性收缩的心脏组织且已经成为一个值得关注的研究问题，然而在这个过程中心肌细胞经历了怎样的发育过程并实现了心肌组织的重塑呢，这个科学问题还需要进一步讨论。

在传统意义上认为哺乳动物的心肌细胞是终末分化的细胞，且基本没有增殖能力，其不能进入细胞周期进而不能通过去分化和再分化的过程恢复完整的功能。但新近研究表明，斑马鱼的心肌细胞在其发育的整个阶段可以保持增殖潜力，成年斑马鱼可以在部分手术切除高达20％的心室后实现心脏的完全恢复，甚至发现心肌细胞可通过去分化促进细胞再进入周期实现细胞增殖。类似研究也表明，心肌去分化的现象也发生在心肌梗死边界区。

与体内生理病理条件相比，模拟体内三维微环境，体外构建的工程化心肌组织确实在心肌组织重建中具有特殊意义。过去我们实验室，已开展了大量的工程化心肌组织构建的研究，已成功构建了利用新生大鼠心肌细胞与胶原/Matrigel混合的心肌组织。胶原和基质胶是常用的天然材料用于组织工程，它们是心肌组织工程构建中重要的支架材料。然而，基于胶原/Matrigel构建的心肌组织中是心肌细胞如何发育，是否同样存在心肌细胞的分化与去分化现象尚未有报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种工程化心肌组织中心肌细胞去分化重塑的方法。

一种工程化心肌组织中心肌细胞去分化重塑的方法，包括如下步骤：

(1)取哺乳动物肌腱，剪碎，溶于醋酸溶液中,12000rpm/4℃离心后取上清，制成Ⅰ型胶原；

(2)将Ⅰ型胶原，基质胶matrigel，DMEM溶液混合，并用NaOH溶液调为中性，制成混合物；

(3)取哺乳动物的心肌细胞，与步骤(2)制备的混合物混合，接种到孔板中，在的培养箱中预培养0.5-1h后，添加培养基，培养至心肌重塑形成。

所述醋酸溶液的质量分数为1％；所述Ⅰ型胶原的浓度为2mg/ml。

所述Ⅰ型胶原，基质胶，DMEM的质量比为5:4:1；所述DMEM溶液的质量浓度为0.1-10％。

所述NaOH溶液的浓度为0.1M。

所述哺乳动物的心肌细胞的细胞密度为2-9×10⁶cells/ml。

所述孔板为12孔板，接种量为每孔1ml。

所述培养箱的培养条件为37uC/5％CO₂。

所述培养基的成分包括85wt％高糖DMEM和15wt％FBS。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明以胶原/基质胶为支架材料，新生SD大鼠心肌细胞为种子细胞，体外构建了工程化心肌组织。利用免疫荧光染色的方式，对EHT中巨噬细胞的变化规律做了初步探讨，结果显示，CD206阳性细胞数逐渐增加而CD86阳性细胞数则逐渐降低。本发明的方法将工程化心肌组织中心肌细胞去分化并且重塑，深入阐明心肌细胞的再生机制并提高EHT的构建质量。

附图说明

图1是本发明的大鼠心肌细胞培养3天的EHT中心肌细胞发生去分化电镜图。

图2是TEM分析工程化心肌组织中心肌细胞的重塑电镜图。