[发明专利]一种用于原位杂交或免疫组化检测的阳性参照物及其制备方法

权利要求书

1.一种用于原位杂交或免疫组化检测的阳性参照物，由以下方法制备得到：

步骤1：将已知原位杂交或免疫组化染色阳性的肿瘤组织用福尔马林缓冲液固定，切成1.0-2.0cm×1.0-2.0cm、厚度为0.3-0.4cm的组织块，脱水、浸蜡,石蜡包埋制得阳性组织蜡块，HE染色定位，选择阳性组织蜡块上代表性病变组织区域；

步骤2：将石蜡和蜂蜡按质量比50:1的比例混合熔化成蜡液，将所得蜡液注入包埋模具中，冷却，制得空白蜡块，用内径为0.8-2.0mm的组织芯片穿刺针在空白蜡块中穿刺打孔；

步骤3：用内径为0.8-2.0mm的组织芯片穿刺针在步骤1所得的代表性病变组织蜡块穿刺取样后置入步骤2所得的空白蜡块穿刺孔中，加热使加入的病变组织与蜡块融合，冷却，烫熔表面,加上塑料组织包埋框和石蜡液，冷冻，脱模制得组织芯片蜡块；

步骤4：将步骤3所得的组织芯片蜡块切成厚度为4-10um的薄片，二甲苯溶解石蜡，离心，弃上清液，100％乙醇洗涤，离心，弃上清液，95％乙醇洗涤，离心，弃上清液，加入95-100％乙醇稀释至每毫升溶液中含500-1000个组织片段，制得阳性参照物。

2.如权利要求1所述的阳性参照物，其特征在于：步骤1中所述的福尔马林缓冲液的浓度为10％。

3.如权利要求1所述的阳性参照物，其特征在于：步骤1中所述的组织块为1.5cm×1.5cm、厚度为0.3cm。

4.如权利要求1所述的阳性参照物，其特征在于：步骤1中所述的脱水为全自动密闭式脱水机脱水。

5.如权利要求1所述的阳性参照物，其特征在于：步骤1中所述HE染色定位的方法是将阳性组织蜡块切片，HE染色，显微镜观察有代表性病变组织，定位。

6.如权利要求1-5任一项所述的阳性参照物，其特征在于：步骤2和3中所述的组织芯片穿刺针的直径为1.0mm。

7.如权利要求1-5任一项所述的阳性参照物，其特征在于：步骤4中所述的薄片厚度为4-8um；优选地，步骤4中所述的薄片厚度为6um。

8.如权利要求1-7任一项所述的阳性参照物，其特征在于：步骤4中所述的阳性参照液的浓度为每毫升溶液中含700-800个组织片段。

9.权利要求1所述的阳性参照物的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：将已知原位杂交或免疫组化染色阳性的肿瘤组织用福尔马林缓冲液固定，切成1.0-2.0cm×1.0-2.0cm、厚度为0.3-0.4cm的组织块，脱水、浸蜡,石蜡包埋制得阳性组织蜡块，HE染色定位，选择阳性组织蜡块上代表性病变组织区域；

步骤2：将石蜡和蜂蜡按质量比50:1的比例混合熔化成蜡液，将所得蜡液注入包埋模具中，冷却，制得空白蜡块，用内径为0.8-2.0mm的组织芯片穿刺针在空白蜡块中穿刺打孔；

步骤3：用内径为0.8-2.0mm的组织芯片穿刺针在步骤1所得的代表性病变组织蜡块穿刺取样后置入步骤2所得的空白蜡块穿刺孔中，加热使加入的病变组织与蜡块融合，冷却，烫熔表面,加上塑料组织包埋框和石蜡液，冷冻，脱模制得组织芯片蜡块；

步骤4：将步骤3所得的组织芯片蜡块切成厚度为4-10um的薄片，二甲苯溶解石蜡，离心，弃上清液，100％乙醇洗涤，离心，弃上清液，95％乙醇洗涤，离心，弃上清液，加入95-100％乙醇稀释至每毫升溶液中含500-1000个组织片段的阳性参照物，4℃保存备用。

10.如权利要求9所述的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：将已知原位杂交或免疫组化染色阳性的肿瘤组织用10％福尔马林缓冲液固定，切成1.0-2.0cm×1.0-2.0cm、厚度为0.3-0.4cm的组织块，全自动密闭式脱水机脱水、浸蜡,石蜡包埋制得阳性组织蜡块，将所得的阳性组织蜡块切片，HE染色，显微镜观察有代表性病变组织，选择阳性组织蜡块上代表性病变组织区域；

步骤2：选用高纯度的石蜡和蜂蜡按质量比50:1的比例混合熔化成蜡液，将所得蜡液注入包埋模具中，室温下使蜡块自然冷却,制得空白蜡块，待其凝固且稍软时,用内径为1.0mm的组织芯片穿刺针在空白蜡块中穿刺打孔，各孔间距紧凑排列，相距1mm，每排打4个孔，共计5排；

步骤3：用内径为1.0mm的组织芯片穿刺针在步骤1所得的代表性病变组织蜡块穿刺取样后置入步骤2所得的空白蜡块穿刺孔中，加热使加入的病变组织与蜡块融合，冷却，烫熔表面,加上塑料组织包埋框和石蜡液，冷冻，脱模制得组织芯片蜡块；

步骤4：将步骤3所得的组织芯片蜡块切成厚度为6um的薄片，二甲苯溶解石蜡，离心，弃上清液，100％乙醇洗涤，离心，弃上清液，95％乙醇洗涤，离心，弃上清液，加入95-100％乙醇稀释至每毫升溶液中含700-800个组织片段的阳性参照物，4℃保存备用。