[发明专利]水稻普通核不育系的创制方法和应用

权利要求书

1.一种水稻普通核不育系的创制方法，其特征在于，具体步骤如下：

1)通过基因编辑技术使水稻普通可育株系MsMs的育性基因表达水平降低或消失，获得水稻普通核不育材料，自交后获得含有不育性状且不含基因编辑载体的新的水稻普通核不育系msms；

2)构建工程核不育中间父本载体，将该载体导入水稻普通核不育系msms，获得转基因苗；种植转基因苗，收获T0代种子，种植T0代种子，获得T1代植株，PCR检测，以获得含有目的基因的拟可育中间父本材料，收获T1代种子；

3)种植T1代种子，PCR检测，获得不含筛选标记基因的可育中间父本材料msms^Ms-L；

4)以水稻普通核不育系msms为母本，以可育中间父本材料msms^Ms-L为父本，杂交，产生混合种子；

5)对混合种子进行荧光分选，分选出不含荧光的种子msms，用于与可育恢复系水稻MsMs进行杂交制种，产生的F1代杂交种子Msms，用于大田生产；分选出含荧光的种子msms^Ms-L用于继续繁殖不含荧光的种子msms。

2.根据权利要求1所述的一种水稻普通核不育系的创制方法，其特征在于，所述步骤1)中，选择普通可育株系MsMs作为受体，利用基因编辑CRISPR-Cas9的方法，定点突变普通可育株系MsMs的雄性不育基因的靶标序列，培育、测序、筛选，得到普通核不育株系msms。

3.根据权利要求1所述的一种水稻普通核不育系的创制方法，其特征在于，步骤2)所述的中间父本载体为包含可育基因和分选基因的水稻双元表达载体。

4.根据权利要求3所述的一种水稻普通核不育系的创制方法，其特征在于，步骤2)所述的中间父本载体中包含的分选基因为红色荧光蛋白DsRed。

5.根据权利要求2所述的一种水稻普通核不育系的创制方法，其特征在于，所述步骤1)中的育性基因为CYP703A3；所述靶标序列如SEQ ID NO.2所示。

6.根据权利要求5所述的一种水稻普通核不育系的创制方法，其特征在于，所述步骤2)中构建工程核不育中间父本载体的过程如下：

以普通可育株系MsMs提取的基因组DNA作为模板，设计并合成特异性引物：

9311gDNAF(其序列如SEQ ID NO.7所示)：GGGATGGGTGTTTGACTCTG；

9311g DNAR(其序列如SEQ ID NO.8所示)：CCTGTGCTCACTCGGAAG；

扩增出如SEQ ID NO.9所示的大小为4429bp的基因组序列片段后，以该基因组序列片段构建“育性恢复基因-分选基因”的工程核不育中间父本载体。

7.根据权利要求6所述的一种水稻普通核不育系的创制方法，其特征在于，所述工程核不育中间父本载体构建过程为：通过In-Fusion转化体系将扩增后如SEQ ID NO.9所示的DNA片段插入到含有分选基因红色荧光蛋白DsRed的载体中；获得水稻双元表达载体pCambia1300-DsRed-CYP703A3，其基因序列如SEQ ID NO.10所示。

8.根据权利要求7所述的水稻普通核不育系的创制方法，其特征在于，所述拟可育中间父本材料创制过程如下：将水稻双元表达载体pCambia1300-DsRed-CYP703A3导入根癌农杆菌中得到互补根癌农杆菌EHA105转化体，通过与水稻普通核不育系msms的细胞或组织接触，从而使编码不育基因的核苷酸转入水稻细胞，并且整合到水稻细胞的染色体上，获得转基因苗；种植转基因苗，收获T0代种子，种植T0代种子，获得T1代植株，PCR检测，获得拟可育中间父本材料。

9.一种水稻普通核不育系的水稻双元表达载体，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

10.权利要求1～8任一所述的方法用于水稻普通核不育系的育性恢复的应用。