[发明专利]水稻普通核不育系的创制方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于水稻育种技术领域，具体涉及一种水稻普通核不育系的创制方法和应用。

背景技术

水稻是全世界重要的粮食作物，世界上约有50％的人口以水稻为主食，大米也是加工许多食品的原材料。“三系法”和“两系法”是当前水稻杂交优势利用的主要途径，但是“三系法”的问题在于受严格的恢保关系制约，可以利用的亲本资源有限；“两系法”在制种安全性问题上存在较大的风险，限制了这两种途径全面开发水稻杂种优势的潜力。

普通核不育具有来源广泛、无恢保关系限制、败育彻底且育性不受环境影响、单隐性基因控制易于转育等特点，是理想的杂种优势利用资源，但普通核不育的繁殖问题是制约普通核不育发展的重要问题。水稻工程核不育体系的创制研究，建设“第三代杂交水稻”应用体系。“第三代杂交水稻”技术就是拟通过基因工程手段解决普通核不育的繁殖问题的技术方法。主要的技术方法有SPT技术、工程核不育技术。“第三代杂交水稻”是基于普通核不育资源的一种杂种优势利用方式。杂种优势利用水平的提高，可以有更多的水稻资源被用于作为杂交稻的父母本，为选育高产、优质、高抗等综合性状优良的品种提供了更好的平台。

普通核不育资源主要来源于人工诱变和自然突变，属于非定向突变，然后从不定向的突变中，经过大量的筛选，获得具有感兴趣目的性状的材料。应用中遇到的问题是：构建“第三代杂交水稻”体系所需要的普通核不育资源，需要已经被基因克隆的普通核不育基因(即基础研究比较透彻的基因)在基因组层面上定点改变基因的表达，从而改变目的性状，这些突变体来源的材料通常不是育种家当前最期待直接利用的材料(基础研究的材料在生产中已经不是最好最新的材料)，所以要将这些材料用于生产中，还必须通过回交转育等方式，是一个耗时较长、工作量较大的一项工作。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种水稻普通核不育系的创制方法和应用，采用基因编辑的技术，让普通的可育材料，变成普通核不育系，再由普通核不育系通过杂交产生可持续恢复育性的方法，极大程度上拓宽了“第三代杂交水稻”不育系资源的来源。

为解决上述问题，一方面，本发明在于提供一种水稻普通核不育系的创制方法，其具体步骤如下：

1)通过基因编辑技术使水稻普通可育株系MsMs的育性基因表达水平降低或消失，获得水稻普通核不育材料，自交后获得含有不育性状且不含基因编辑载体的新的水稻普通核不育系msms；

2)构建工程核不育中间父本载体，将该载体导入水稻普通核不育系msms，获得转基因苗；种植转基因苗，收获T0代种子，种植T0代种子，获得T1代植株，PCR检测，以获得含有目的基因的拟可育中间父本材料，收获T1代种子；

3)种植T1代种子，PCR检测，获得不含筛选标记基因的可育中间父本材料msms^Ms-L；

4)以水稻普通核不育系msms为母本，以可育中间父本材料msms^Ms-L为父本，杂交，产生混合种子；

5)对混合种子进行荧光分选，分选出不含荧光的种子msms，实现水稻普通核不育系的繁殖，用于与可育恢复系水稻MsMs进行杂交制种，产生的F1代杂交种子Msms，用于大田生产；分选出含荧光的种子msms^Ms-L继续用于繁殖不含荧光的种子msms。

进一步地，本发明提供一种水稻普通核不育系的创制方法，所述步骤1)中，选择普通可育株系MsMs作为受体，利用基因编辑CRISPR-Cas9的方法，定点突变普通可育株系MsMs的雄性不育基因的靶标序列，培育、测序、筛选，得到普通核不育株系msms。

更进一步地，本发明提供一种水稻普通核不育系的创制方法，步骤1)中所述靶标序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，本发明提供一种水稻普通核不育系的创制方法，步骤2)所述的中间父本载体为包含可育基因和分选基因的水稻双元表达载体。

更进一步地，本发明提供一种水稻普通核不育系的创制方法，步骤2)所述的中间父本载体中包含的分选基因为红色荧光蛋白DsRed。

进一步地，本发明提供一种水稻普通核不育系的创制方法，所述步骤1)中的育性基因为CYP703A3。

进一步地，本发明提供一种水稻普通核不育系的创制方法，所述步骤2)中构建工程核不育中间父本载体的过程如下：

以普通可育株系MsMs提取的基因组DNA作为模板，设计并合成特异性引物：

9311gDNAF(其序列如SEQ ID NO.7所示)：GGGATGGGTGTTTGACTCTG；