[发明专利]聚酰胺‑胺树状大分子与纳米金颗粒的复合物作为非病毒载体进行基因转染的应用方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种聚酰胺-胺树状大分子与纳米金颗粒的复合物作为非病毒载体进行基因转染的应用方法，特别涉及一种聚乙二醇和叶酸修饰的聚酰胺-胺树状大分子包裹纳米金颗粒作为非病毒载体进行基因转染及免疫安全性研究的应用方法，属于功能化高分子纳米材料基因转染载体技术领域。

背景技术

基因治疗是指通过基因水平的操作而达到治疗或预防疾病的方法。目前，基因治疗主要是针对严重威胁人类健康的疾病进行治疗，癌症是其主要应用领域。基因治疗技术如今发展迅速，部分基因治疗方案已经进入临床试验阶段。在临床试验时，发现了很多安全隐患，比如其安全性、靶向性、转移效率较低等问题尚未解决。

目前，在基因载体系统中主要分为两部分，病毒载体系统和非病毒载体系统。病毒载体由于其高效的转染效率从而应用于临床上的基因治疗。但是由于其体积小，所以运载基因的数量有限，而且容易产生基因突变和免疫原性。然而，非病毒载体的生物安全性好，免疫原性低。其与脂质体、多聚物和DNA复合物等产品的相继出现，促使非病毒载体在基因治疗中的广泛应用。

非病毒载体系统中，树状大分子能作为一种理想的纳米材料应用于基因传递系统。其区别于传统的线性聚合物类纳米材料，具有独特的高度支化三维立体结构，有良好的单分散性。树状大分子经过各种表面化修饰，如聚乙二醇化、乙酰化和烷基化等，产生了不同的理化性质。研究表明，第五代树状大分子有一定的细胞毒性，但是与纳米金颗粒形成复合物[Shan Y.，Luo T.，Peng C.，et al.，Gene delivery using dendrimer-entrapped gold nanoparticles as nonviral vectors[J]. Biomaterials，2012，33(10)：p.3025-3035.]会降低载体的毒性。Xiao等[Xiao T.，Hou W.，Cao X.，et al.，Dendrimer-entrapped gold nanoparticles modified with folic acid for targeted gene delivery applications.Biomaterials Science，2013，1(11)：p.1172.]将叶酸修饰到第五代树状大分子(PAMAM)表面，与基因在特定比例下产生了更高的基因转染效率。

从分子生物学角度分析基因转染的免疫安全性，其中实时荧光定量反转录 PCR技术是基因转录水平上检测基因表达量的重要检测手段，在生物医学领域应用广泛。实时荧光定量反转录PCR技术一般采用2^-△△Ct法，计算实验组与对照组中基因的相对表达量。公式是△△Ct＝(Ct目的基因-Ct对照基因)实验组-(Ct 目的基因-Ct对照基因)对照组，Ct值是荧光信号达到阈值时的体系循环数目。

检索国内外相关文献和专利结果表明：聚乙二醇和叶酸共同修饰聚酰胺-胺树状大分子包裹纳米金颗粒作为基因载体进行基因转染，运用实时荧光定量反转录PCR技术对基因转染后的免疫安全性检测尚未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种聚酰胺-胺树状大分子与纳米金颗粒的复合物作为非病毒载体进行基因转染的应用方法，得到的复合物能具有良好生物相容性、细胞免疫安全性以及高效基因转染效率，在恶性肿瘤的基因治疗等方面有较好的应用前景。

为了解决上述问题，本发明提供了一种聚酰胺-胺树状大分子与纳米金颗粒的复合物作为非病毒载体进行基因转染的应用方法，其特征在于，所述树状大分子的表面是氨基末端，对其进行化学修饰可降低其毒性并提高转染效率；其末端连接靶向基团包括叶酸，RGD，透明质酸，能高效地进行基因传递。

优选地，所述化学修饰的方法为修饰聚乙二醇、修饰环糊精、乙酰化和烷基化的方法中的任意一种或几种。

优选地，所述复合物中Au与G5.NH₂摩尔比为25∶1及以上。

更优选地，所述复合物中Au与G5.NH₂摩尔比为25∶1、50∶1、75∶1或100∶1。

优选地，所述复合物在基因转染体系中的浓度为1.0～2.0mg/mL。

优选地，所述基因传递的传递外源治疗基因包括pDNA，CpG DNA，反义核苷酸，siRNA及ssDNA中的任意一种或几种。

更优选地，所述基因传递的外源治疗基因的目标细胞包括癌细胞及体细胞。