[发明专利]一种核酸杂交化学发光检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种核酸检测方法，特别涉及一种核酸杂交化学发光检测方法，属于生物技术领域。

背景技术

目前主流的核酸检测技术有基因测序、基因芯片、聚合酶链式反应等，以及基于非靶标物质扩增的技术，例如基于抗体捕获的第二代杂交捕获技术(德国凯杰公司的HC2)，基于RNA逆转录的核酸序列扩增技术(美国豪洛捷)，基于支链DNA信号放大的快速捕获杂交技术(科蒂亚生物)等。但目前的各种方法均存在各种不足，如基因测序成本居高不下，基因芯片操作复杂、检测灵敏度低，聚合酶链式反应对实验室要求高等。

发明内容

本发明的目的在于提供一种核酸杂交化学发光检测方法，该方法可以快速捕获杂交目标核酸。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种核酸杂交化学发光检测方法，该方法包括如下步骤：

(1)根据检测的目标核酸的序列设计捕获核酸序列和信号核酸序列，其中捕获核酸序列5’端进行氨基修饰，信号核酸序列5’标记生物素；

(2)将捕获核酸序列固定到基质上；

(3)通过核酸杂交反应，捕获核酸序列和目标核酸结合；

(4)通过核酸杂交反应，标记了生物素的信号核酸序列和结合在捕获核酸序列上的目标核酸结合；

(5)通过生物素-亲和素的特异性结合反应，把标记了链霉亲和素的微球结合到信号核酸序列上；

(6)通过生物素-亲和素的特异性结合反应，生物素-碱性磷酸酶和微球上的链霉亲和素结合；

(7)通过上述反应固定到基质上的生物素-碱性磷酸酶和发光底物反应，通过化学发光分析仪读取结果，根据检测值和空白对照值的差异来判断待测的样本中是否含有目标核酸。一般来讲，检测值和空白对照值具有显著差异，可以认为待测的样本中含有目标核酸。经过发明人多次试验摸索，检测值和空白对照值的比值大于1.5时，可以认为待测的样本中含有目标核酸；否则待测的样本中不含有目标核酸。

本发明建立了一种新的核酸物质检测方法，通过该方法的建立扩大核酸检测产品在医疗、科研、食品安全等领域的使用范围。本发明方法通过基质、捕获核酸序列、目标核酸、标记生物素的信号核酸序列、标记链霉亲和素的微球和生物素-碱性磷酸酶、发光底物等对目标核酸进行特异性检测。

作为优选，所述的微球是聚苯乙烯(PS)、交联聚苯乙烯/聚二乙烯基苯(P[S/DVB])或聚甲基丙烯酸酯(PMMA)微球，微球的直径为50-500nm。本发明采用的微球是表面聚合链霉亲和素的微球。

作为优选，所述捕获核酸序列和目标核酸的特定片段互补，且长度在15-50个碱基。

作为优选，所述信号核酸序列和目标核酸的特定片段互补，且长度在15-50个碱基。

作为优选，所述基质是微孔板、微球、玻片、硅片或微流体芯片。

作为优选，当基质是氨基修饰的微孔板则通过戊二醛固定，当基质是羧基修饰的微球时，通过1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺固定。

作为优选，捕获核酸序列和信号核酸序列分别针对目标核酸的不同片段。

作为优选，所述发光底物是C₁₈H₂₁Na₂O₇P(AMPPD)、C₁₈H₂₀ClNa₂O₇P(CSPD)、C₁₈H₂₀ClNa₂O₇P(ADP-Star)或C₁₈H₁₉Cl₂O₇Na₂P(CDP-Star)。

本发明的有益效果是：本发明通过捕获核酸序列将目标核酸杂交捕获，再经过信号核酸序列、微球、生物素-亲和素以及碱性磷酸酶的活性即可实现信号放大，从而检测到目标核酸的信号。相对于PCR技术需要扩增，本发明在不增加检测物浓度的前提下实现目标核酸的检测，且具有稳定性好，成本低，检测速度快，对环境要求低等优点。

附图说明

图1是本发明方法的作用机理示意图；

图中：1基质、2捕获核酸序列、3目标核酸、41生物素、42信号核酸序列、51微球、52链霉亲和素、61生物素-碱性磷酸酶。

具体实施方式