[发明专利]一种利于苹果愈伤的苹果MdARF5基因及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种利于苹果愈伤的苹果MdARF5基因及其应用，属于分子生物学技术领域。

背景技术

铝离子对植物具有毒害作用，是植物生长的主要限制因子。铝胁迫下植物通过根分泌有机酸螯合根际活性铝是其一种抗铝离子胁迫的主要方式。近几十年来，我国苹果产业中由于过量施氮，导致土壤酸化，在酸性土壤中,铝离子被活化，易被植物吸收利用，从而抑制了果树的生长发育，降低了园艺产品食用的安全性。因此，亟待研究植物提高铝离子胁迫抗性的机理，对于果树的抗性和品质起到关键作用。

最近研究表明，H⁺-ATP酶活性提高有助于有机酸的外泌，进而抑制铝离子的吸收，AHAs属于一类H⁺-ATP酶，它们在有机酸分泌和铝离子抗性方面起到重要作用，前期研究也发现，生长素信号在调控有机酸外泌上也发挥重要作用，但是其机理不清楚。我们在研究过程中克隆了苹果MdARF5基因，研究表明了MdMIEL1响应多种激素信号和胁迫响应，过量表达MdMIEL1提高了转基因苹果愈伤和转基因拟南芥的抗盐和抗旱能力。我们的研究发现，苹果MdARF5能够促进AHA基因表达，提高H⁺-ATPase活性，进而增加了根系中有机酸的外泌，最终提高苹果愈伤对铝离子胁迫的抗性。

发明内容

本发明首次通过植物基因工程技术改善植物抗盐、抗旱性和其他有益生产性状，从苹果组培苗中分离克隆出的抗逆相关基因完整编码区段的DNA片段，并验证了该基因的功能，利用其功能最终发现采用超量表达之后转基因植株抗盐和抗干旱能力明显提高。

本发明的目的之一，是提供一种利于苹果愈伤的苹果MdARF5基因。本发明的申请人从苹果中分离克隆出的抗盐相关基因完整编码区段的DNA片段，并命名为MdARF5。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种利于苹果愈伤的苹果MdARF5基因，所述MdARF5基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，所述MdARF5基因的核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

本发明的目的之二，是提供上述利于苹果愈伤的苹果MdARF5基因的操作方法。本操作方法的技术流程成熟，适合产业化应用。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种利于苹果愈伤的苹果MdARF5基因的操作方法，包括以下步骤：

(1)提取苹果组培叶片中的RNA及反转录；

(2)cDNA全长序列的获得：根据NCBI查到的苹果愈伤中MIEL1基因保守氨基酸序列，设计兼并引物MdARF5-F、MdARF5-R，然后以反转录合成的苹果基因组cDNA为模板进行PCR扩增，得到cDNA全长序列；其中，MdARF5-F序列如SEQ.ID.NO.3所示，MdARF5-R序列如SEQ.ID.NO.4所示；

(3)PCR产物进行回收、载体连接、转化、测序，即得到所述苹果MdARF5基因。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，步骤(2)中，所述PCR扩增的反应体系为：

PCR反应程序为94℃预变性5min；循环参数为94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸90s，进行32个循环；72℃充分延伸10min。

本发明的目的之三，是提供上述利于苹果愈伤的苹果MdARF5基因在转基因苹果愈伤中的应用。本发明的申请人利用强启动子(花椰菜花叶病毒35S启动子)驱动原理的转基因技术，将MdARF5基因的超量表达载体转入苹果愈伤中，从而获得转基因植株。实验证明，超量表达MdARF5基因的转基因苹果愈伤在盐和干旱胁迫下，死亡率相比于野生型明显降低，说明MdARF5基因在植株抗逆中发挥重要作用。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种如上所述的利于苹果愈伤的苹果MdARF5基因在转基因苹果愈伤中的应用。

本发明的有益效果是：

1.本发明首次通过植物基因工程技术改善植物抗盐、抗旱性和其它有益生产性状，从苹果组培苗中分离克隆出的抗逆相关基因完整编码区段的DNA片段，并验证了该基因的功能，利用其功能最终发现采用超量表达之后转基因植株抗盐和抗干旱能力明显提高。

2.本发明的利于苹果愈伤的苹果MdARF5基因的操作方法的技术流程成熟，适合产业化应用。

3.本发明的利于苹果愈伤的苹果MdARF5基因可以应用在转基因苹果愈伤中，MdARF5基因在植株抗逆中发挥重要作用。