[发明专利]一种用于EB病毒荧光定量PCR检测的引物和探针组、及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于EB病毒荧光定量PCR检测的引物和探针组、及试剂盒，属于生物检测技术领域。

背景技术

在早期婴幼儿时体液免疫功能还没有发育完善，处于相对低水平，或在EB病毒感染早期，抗体检测也为阴性，且抗体检测也容易受到类风湿因子的干扰而出现假阳性结果，所以EB的抗体检测不能很好地客观反映婴幼儿的EB病毒感染的真实情况。

但随着实时荧光PCR检测技术的临床应用，EB病毒DNA作为EB感染的分子生物学标记，具有特异性强、敏感性高、精确性高的优点，医生可以根据病人体内病毒载量的多少可以推测病人EB病毒的感染状况，及时有效的进行抗病毒治疗，对于避免滥用抗生素和及时缓解病情都具有积极意义。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种用于EB病毒荧光定量PCR检测的引物和探针组，该引物和探针组可配合对EB病毒特异性的核酸片段体现出良好的扩增效率。

本发明的第二个目的在于提供一种试剂盒，该试剂盒通过特异性的引物和探针、在阴性质控品、临界阳性质控品、强阳性质控品的监控下，与阳性标准品进行同步测定，测得的结果具有灵敏度高、准确度高的特点。

实现本发明的第一个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种用于EB病毒荧光定量PCR检测的引物和探针组，包括，

上游引物EB-F：5’CCGGTGTGTTCGTATATGGAG 3’，如SEQ ID NO.1所示；

下游引物EB-R：5’GGGAGACGACTCAATGGTGTA 3’，如SEQ ID NO.2所示；

探针EB-P：5’TGCCCTTGCTATTCCACAATGTCGTCTT 3’，如SEQ ID NO.3所示；探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团。

进一步地，引物和探针根据EB病毒的基因组序列中的靶片段进行设计，该靶片段的序列如SEQ ID NO.4所示；该靶片段位于EB病毒的基因组的高保守区。

实现本发明的第二个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种用于EB病毒荧光定量PCR检测的试剂盒，包括：核酸提取液、红细胞裂解液、PCR反应液、、混合酶液、阴性质控品、临界阳性质控品、强阳性质控品和阳性标准品；PCR反应液包括引物和探针；

引物为：上游引物EB-F：5’CCGGTGTGTTCGTATATGGAG 3’，如SEQ ID NO.1所示；下游引物EB-R：5’GGGAGACGACTCAATGGTGTA 3’，如SEQ ID NO.2所示；

探针为：EB-P：5’TGCCCTTGCTATTCCACAATGTCGTCTT 3’，如SEQ ID NO.3所示；探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；

阴性质控品包括不含EB病毒DNA片段的重组质粒；

临界阳性质控品和强阳性质控品均包括含有EB病毒DNA片段的重组质粒；

阳性标准品包括含有EB靶片段的重组质粒，该靶片段的序列如SEQ ID NO.4所示。进一步地，核酸提取液包括体积百分比0.1-1％的NP-40和1-10％的chelex-100。

进一步地，红细胞裂解液包括质量百分浓度20-50％的蔗糖和体积百分比1-5％的Triton X-100。

进一步地，PCR反应液包括浓度为0.2-0.4mM含dUTP的dNTP、2-7mM的MgCl₂、5-20mM的KCl、0.2-1μM的引物和0.1-0.3μM的探针；上游引物和下游引物等量；

进一步地，混合酶液包括1-5U的Hotstart Taq酶和0.1-0.5U的UNG酶。

进一步地，阳性标准品包括：

阳性标准品1：含有浓度为1.0×10⁴copy/mL的EB靶片段的重组质粒；

阳性标准品2：含有浓度为1.0×10⁵copy/mL的EB靶片段的重组质粒；

阳性标准品3：含有浓度为1.0×10⁶copy/mL的EB靶片段的重组质粒；

阳性标准品4：含有浓度为1.0×10⁷copy/mL的EB靶片段的重组质粒。

进一步地，试剂盒进行PCR的反应体系为：42℃，2min；94℃，2min；94℃，10sec，58℃，1min，45个循环；数据的采集定在58℃。

进一步地，重组质粒为pGE重组质粒。

本发明的待检样本包括但不限于全血。