[发明专利]一种绿脓杆菌外毒素A的高效液相色谱检测方法有效
| 申请号： | 201710429741.5 | 申请日： | 2017-06-09 |
| 公开（公告）号： | CN106990188B | 公开（公告）日： | 2019-11-15 |
| 发明（设计）人： | 张琪;蔡德富 | 申请（专利权）人： | 齐齐哈尔医学院 |
| 主分类号： | G01N30/02 | 分类号： | G01N30/02 |
| 代理公司： | 11690 北京领科知识产权代理事务所(特殊普通合伙) | 代理人： | 张丹<国际申请>=<国际公布>=<进入国 |
| 地址： | 161021黑龙江省*** | 国省代码： | 黑龙;23 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 绿脓杆菌 毒素 高效 色谱 检测 方法 | ||
1.一种利用HPLC法检测绿脓杆菌外毒素A的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)取绿脓杆菌发酵液和甲醇进行混合浸泡，再加入NaOH溶液，置于摇床上振摇提取，离心得到含有绿脓杆菌外毒素A的上清液，取上清过滤，获得样品溶液；
(2)使用HPLC法测定，流动相为甲醇、乙腈和水；起始流动相中甲醇、乙腈和水的体积比为10：15：75，洗脱3-5分钟；之后甲醇、乙腈和水的体积比连续性调整为30：35：35，洗脱10-15分钟；之后甲醇、乙腈和水的体积比连续性调整为30：40：30，洗脱5-10分钟；之后甲醇、乙腈和水的体积比连续性调整为35：45：20，洗脱3-5分钟；之后甲醇、乙腈和水的体积比调整为10：15：75，洗脱3-5分钟；
其中，所述的HPLC法中分离色谱柱选自TC-C18色谱柱、HypersilBDS、HypersilODS、LiChrosorb、SHIMADZUVP-ODS、Inertsil ODS-SP、Extend-C18、ZORBAXODS、ZORBAXSB-C18、LiChrosorbC18、HypersilODS中的一种；
色谱条件为：柱温为30-40℃；流动相的流速为0.3-1.5ml/min；波长为200-220nm；进样量10μl；柱长为150mm，柱内径为5μm。
2.如权利要求1所述的利用HPLC法检测绿脓杆菌外毒素A的方法，其特征在于：所述的分离色谱柱为TC-C18色谱柱。
3.如权利要求1-2任一项所述的利用HPLC法检测绿脓杆菌外毒素A的方法，其特征在于：所述的色谱条件为柱温为35℃。
4.如权利要求3所述的利用HPLC法检测绿脓杆菌外毒素A的方法，其特征在于：流动相的流速为1ml/min。
5.如权利要求1、2、4任一项所述的利用HPLC法检测绿脓杆菌外毒素A的方法，其特征在于：波长为210nm。
6.如权利要求1所述的利用HPLC法检测绿脓杆菌外毒素A的方法，其特征在于：步骤(2)为：使用HPLC法测定，流动相为甲醇、乙腈和水；起始流动相中甲醇、乙腈和水的体积比为10：15：75，洗脱5分钟；之后甲醇、乙腈和水的体积比连续性调整为30：35：35，洗脱15分钟；之后甲醇、乙腈和水的体积比连续性调整为30：40：30，洗脱10分钟；之后甲醇、乙腈和水的体积比连续性调整为35：45：20，洗脱5分钟；之后甲醇、乙腈和水的体积比调整为10：15：75，洗脱5分钟。
7.如权利要求1所述的利用HPLC法检测绿脓杆菌外毒素A的方法，其特征在于：步骤(2)为：使用HPLC法测定，流动相为甲醇、乙腈和水；起始流动相中甲醇、乙腈和水的体积比为10：15：75，洗脱3分钟；之后甲醇、乙腈和水的体积比连续性调整为30：35：35，洗脱10分钟；之后甲醇、乙腈和水的体积比连续性调整为30：40：30，洗脱5分钟；之后甲醇、乙腈和水的体积比连续性调整为35：45：20，洗脱3分钟；之后甲醇、乙腈和水的体积比调整为10：15：75，洗脱3分钟。
8.如权利要求1所述的利用HPLC法检测绿脓杆菌外毒素A的方法，其特征在于：使用的HPLC的流动相中还含有有机酸。
9.如权利要求8所述的利用HPLC法检测绿脓杆菌外毒素A的方法，其特征在于：所述有机酸为甲酸、乙酸或丁酸中的一种或多种。
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