[发明专利]一种绿脓杆菌外毒素A的高效液相色谱检测方法

说明书

本发明属于药物分析领域，具体涉及一种绿脓杆菌外毒素A的高效液相色谱检测方法。本发明的HPLC分析方法，提高了绿脓杆菌外毒素A样品分析的准确性和快速性。

技术领域

本发明属于药物分析领域，具体涉及一种绿脓杆菌外毒素A的HPLC分析检测方法。

背景技术

绿脓杆菌，又称铜绿假单胞菌(学名Pseudomonasaeruginos′)，是一种革兰氏阴性菌、好氧、呈长棒形的细菌，只有单向的运动性。它是一种机会性感染细菌，且对植物亦是机会性感染的。与其他假单胞菌属的细菌一样，绿脓杆菌分泌多种的色素，包括绿脓菌素(呈青色)、萤光素(呈荧光黄色)及绿脓菌红素(呈绯红色)。假单胞菌属培养基P就是用作增加绿脓菌素及绿脓菌红素的生产，而假单胞菌属培养基F就是加强萤光素的生成。

绿脓杆菌是1882年首先由Gersard氏从伤口脓液分离得到。该菌在自然界广泛存在于水、土壤、空气以及动物的肠道和皮肤中，为一种条件性致病菌，在特定的情况下能引起人及动物感染发病，如规模化养狐场母狐的流产、羊群的化脓性肺炎、雏鸡的败血症以及绿脓杆菌感染鹧鸪、鸽和人等。随着养殖业规模的不断扩大，由绿脓杆菌引起的疫病也呈现上升的趋势。绿脓杆菌对禽属条件性致病性菌，常从正常禽的肠道、呼吸道和卵中分离出来，能引起各种年龄的禽发病，致死率在1％～90％以上，应激是幼禽暴发绿脓杆菌病的主要原因。该菌给规模化养殖场和人类的健康造成了很大威胁。在人体上，绿脓杆菌能引起术后和伤口的感染，还能引起人的关节炎和角膜炎等疾病，免疫力下降是重要的发病诱因。绿脓杆菌的毒素残留还能引起食物中毒。

1972年，P.v.Liu在临床分离株的培养液中，发现了导致绿脓杆菌感染的毒性因子——外毒素A，并指出绿脓杆菌外毒素A(PEA)对皮肤黏膜有坏死作用，进入血液中能诱发败血症。在脏器组织细胞中，绿脓杆菌外毒素A与白喉毒素类似，具有阻碍蛋白质合成的作用；对小鼠和大鼠感受性高，具有致死作用。对培养细胞有“细胞崩坏毒性”。绿脓杆菌外毒素A的毒性最强，能够对机体组织及器官造成极大危害，甚至能够破坏角膜基质细胞。为了探讨有效控制和治疗绿脓杆菌外毒素A相关疾病的方法，对绿脓杆菌外毒素A的生物学特性及其致病性的研究也越来越多。

Khan AA等人(Detection of Pseudomonas aeruginosa from clinical andenvironmental samples by amplification of the exotoxin a gene usingPCR.Applied and Environmental Microbiology.1994)公开了一种是用PCR对绿脓杆菌进行检测的方法。陈晨等人(貂源绿脓杆菌的分离鉴定及其致病性，兽类学报，2015)公开了一种貂源绿脓杆菌的分离鉴定的方法。CN101392289B公开了一种环介导等温扩增方法检测绿脓杆菌的试剂盒及方法。CN101429539B公开了一种实时荧光定量PCR检测绿脓杆菌的试剂盒。艾启俊等人(PCR技术检测编码绿脓杆菌外毒素A基因，中国食品学报2006/06)公开了一种检测绿脓杆菌外毒素A基因的方法。虽然现有技术公开了绿脓杆菌或绿脓杆菌外毒素A检测方法，但还存在分辩率低、速度慢、重复性差等问题。特别是分析多个样品时，相互之间还会出现明显的干扰，影响分析的准确性。

发明内容

发明人经过广泛而深入的研究，通过大量的试验、摸索得到了一种绿脓杆菌外毒素A的HPLC检测方法。发明人发现了有效分离、检测绿脓杆菌外毒素A的流动相组成以及流动相的体积比，进一步地，发明人还发现在一定的时间内，采用梯度洗脱方式，使流动相的体积比逐步变化，可以得到更佳的分离、检测效果。

本发明旨在提供一种绿脓杆菌外毒素A的高效液相检测方法。

在本发明中，提供了一种绿脓杆菌外毒素A的检测方法，所述的检测方法为高效液相色谱，其流动相为甲醇、乙腈和水，甲醇、乙腈和水的起始体积比为：(5-15)：(5-20)：(65-90)，甲醇、乙腈和水的最终体积为：(25-50)：(20-50)：(0-55)。