[发明专利]一种β-甘露聚糖酶工程菌的筛选方法

说明书

本发明公开了一种β‑甘露聚糖酶工程菌的筛选方法，包括如下步骤：(1)将β‑甘露聚糖酶的表达菌在含有台酚蓝的KT平板上培养，直至平板上产生水解圈；(2)测量水解圈直径与微生物菌落直径，以二者大小的比值作为β‑甘露聚糖酶的酶活指数，该指数与酶活正相关。本发明无需对工程菌裂解，即可实现胞内β‑甘露聚糖酶酶活的快速检测。所需步骤简单，耗时短，成本低廉，且利于高通量筛选。

技术领域

本发明涉及一种β-甘露聚糖酶突变体的原位快速半定量筛选方法，属于生物工程领域。

背景技术

β-甘露聚糖酶(β-mannanase,EC 3.2.1.78)属于半纤维素酶，可以在β-1,4-D-甘露聚糖分子的主链内部随机切割β-1,4-D-甘露糖苷键，从而产生不同长度的低聚甘露糖。低聚甘露糖作为添加剂在动物饲料行业有广泛的应用，也是膳食纤维的重要成分，此外在造纸、纺织业、医学、药学、食品及石油开采等领域也具有重要的应用价值。

大肠杆菌表达β-甘露聚糖酶具表达量高、培养周期短、成本低等优势。但由于重组的β-甘露聚糖酶多为胞内表达，而底物甘露聚糖属于大分子化合物，无法自由进出大肠杆菌细胞壁，酶活的检测通常需要对细胞进行繁琐、耗时、耗能的破壁处理。特别的，当对β-甘露聚糖酶引入随机突变，而这种突变库通常达到10³以上数量级，对每个突变体逐一进行细胞破壁、重组酶纯化、酶活检测，检测周期以及人力、物力需要都非常巨大，无法高效的实现突变体库的大规模筛选。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于大肠杆菌重组表达β-甘露聚糖酶酶活的半定量筛选方法，该方法无需细胞破壁、蛋白纯化，且可以批量处理，大大缩短了突变体的初筛时间，提高了效率，且操作简便、快速，成本低廉，有利于β-甘露聚糖酶突变体库的高效筛选获得候选突变体。

为实现发明目的采用如下技术方案：

一种β-甘露聚糖酶工程菌的筛选方法，包括如下步骤：

(1)将β-甘露聚糖酶的表达菌在含有台酚蓝的KT平板上培养，直至平板上产生水解圈；

(2)测量水解圈直径与微生物菌落直径，以二者大小的比值作为β-甘露聚糖酶的酶活指数(EI)，该指数与酶活正相关。

步骤(1)所述的培养包括三个阶段：第一阶段为37±2℃保温6-12h；第二阶段为25±2℃保温1-3h；第三阶段为30-60℃保温8-20h。

所述第一阶段为37℃保温10h。

所述第二阶段为25℃保温2h。

所述第三阶段的温度为37℃～50℃。

所述第三阶段的保温时间为12h。

所述KT平板的原料组分为：1-2％蛋白胨、0.5-1％酵母提取物、1％氯化钠、1-3％琼脂和0.3-1％魔芋胶溶液。

所述KT平板的配制：将上述原料混合后115℃条件下高压灭菌20min，冷却后加入预先配制好的1％台酚蓝溶液至终浓度为0.02-0.05％。

所述β-甘露聚糖酶表达菌，其宿主菌为E.coli BL21(DE3)或E.coli BL21。

所述β-甘露聚糖酶表达菌，其表达载体为pET30(a)。

本发明的基本原理是台酚蓝可结合甘露聚糖将其染成蓝色，而β-甘露聚糖酶具有降解甘露聚糖的能力，从而在KT平板上产生透明水解圈，且透明圈直径/微生物菌落直径的比值(EI值)与酶活力正相关。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：