[发明专利]一种比率型荧光检测H2S的试剂及其合成方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及硫化氢检测技术，具体涉及一种比率型荧光检测H₂S的试剂及其合成方法和应用。

背景技术

硫化氢是一种无色有臭鸡蛋气味的气体，长久被认为是有毒的、对环境有害的。但近十几年来，大量的研究发现硫化氢在哺乳动物体内广泛存在，而且发挥着极其重要的生理作用。此外，研究表明硫化氢(H₂S)是继一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后的第三种气体信号分子，具有多种生理功能。在植物体内，硫化氢发挥调节种子发芽，根系生长，叶子气孔打开与闭合，以及细胞渗透压，盐压等功能，在动物体内，硫化氢的作用包括调制血压，缓解缺血性再灌注损伤，发挥抗炎作用，调节细胞内氧化应激压力，降低代谢率等。硫化氢水平的改变与多种疾病相关，如唐氏综合征和阿尔茨海默氏病和心血管疾病等。硫化氢能够发挥降低血压，调节心率的作用。最新的研究发现，硫化氢具有降低癌症发病率的作用。到目前为止，已经有很多方法用来检测体内及体外硫化氢及硫氢根浓度，如：亚甲基蓝法、气相色谱及小分子荧光探针。其中，小分子荧光探针检测由于其具有高灵敏度、高选择性、非侵入性、操作简便及实时成像的特征，已被视为是最有前景的检测技术。

在本发明中，合成了7-(二乙基氨基)-2-氧代-2H-色烯-4-基2-(吡啶-2-基二硫烷基)苯甲酸酯(HS-1)，通过H₂S反应前后荧光强度比值的变化，实现H₂S的检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种比率型荧光检测H₂S的试剂及其合成方法和应用。

本发明提供的一种比率型荧光检测H₂S的试剂，是7-(二乙基氨基)-2-氧代-2H-色烯-4-基2-(吡啶-2-基二硫烷基)苯甲酸酯(HS-1)，英文名:7-(diethylamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl 2-(pyridin-2-yl disulfanyl)benzoate，结构式为：

7-(二乙基氨基)-2-氧代-2H-色烯-4-基2-(吡啶-2-基二硫烷基)苯甲酸酯(HS-1)的合成方法，步骤为：

(1)在N₂保护下，0℃时向丙二酸(1eq.)和苯酚(2eq.)的混合物中缓慢滴加过量的POCl₃，混合物加热到115℃反应直到大量HCl气体被释放(大约1.5h)；上层清液被倾倒在水中，用乙酸乙酯萃取，合并有机层，在旋转蒸发仪上旋干后得棕色油状化合物丙二酸二苯酯；

(2)将化合物丙二酸二苯酯(1eq.)和间羟基-N,N-二乙基苯胺(1eq.)溶解在甲苯中，反应液回流7h；反应完成后冷却至室温，有固体析出，过滤，滤饼用正己烷洗涤，干燥，得黄色固体7-二乙胺基-4-羟基香豆素；

(3)将二巯基吡啶(1eq.)溶于氯仿中，加入2-巯基水杨酸(1eq.)，滴加15mmol氯化亚砜，搅拌1h，生成淡黄色固体，抽滤，干燥得到化合物2-(吡啶-2-基二硫烷基)苯甲酸；

(4)将化合物2-(吡啶-2-基二硫烷基)苯甲酸(1eq.)，7-二乙胺基-4-羟基-香豆素(1eq.)，1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)(1eq.)，和4-二甲基氨基吡啶(DMAP)(0.1eq.)，加入二氯甲烷中，室温搅拌12h；旋转蒸发除去溶剂并将剩余物过硅胶柱，得到黄色固体7-(二乙基氨基)-2-氧代-2H-色烯-4-基2-(吡啶-2-基二硫烷基)苯甲酸酯。

一种比率型荧光检测H₂S的方法，步骤为：

(1)、配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，配制2mM的HS-1的DMSO溶液；

(2)、将2000μL pH 7.4的PBS缓冲溶液、5μL HS-1的DMSO溶液加到干净的荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，随着待测样的加入，403nm的荧光强度逐渐增强，519nm的荧光逐渐减弱；