[发明专利]环介导等温扩增技术检测肺炎支原体的方法

说明书

技术领域

本发明属于以等温扩增为代表的分子生物学检测方法在肺炎支原体检测方面的应用，即肺炎支原体的环介导等温扩增检测技术及其专用引物、检测方法和试剂盒。

背景技术

支原体(Mycoplasma)是介于细菌与病毒之间的一种原核细胞型微生物。迄今为止，能够导致人体感染的支原体大约有20种，其中以肺炎支原体(M.pneumoniae,Mp)最为多见。Mp是引起人类呼吸道感染的重要病原菌之一，每年约有10％～30％的社区获得性肺炎是由其感染引起。Mp感染呈全球性分布，它可以通过飞沫以气溶胶微粒的形式传播，人群普遍易感。当Mp侵入呼吸道后，借滑行运动定位于纤毛毡的隐窝内，以其尖端特殊结构(顶器)牢固的黏附于上皮细胞表面的受体上，抵抗黏膜纤毛的清除和吞噬细胞的吞噬，由此在呼吸道立足。除呼吸道感染外，Mp还可引发严重的肺外并发症，常累及中枢神经系统、心血管系统、皮肤及肝肾器官等。此外，有研究报道Mp感染还是某些自身免疫病(如自身免疫性溶血性贫血)的风险因素，因此，对于临床上疑似Mp感染的患者进行早期实验室诊断变得尤为重要。

目前支原体的实验室诊断金标准为分离培养，但分离培养法通常存在两个弊端，一是检测时间过长，固体平板生长出典型菌落至少需要3周时间，对临床快速诊断意义不大。二是分离培养难度大、要求苛刻，一般医院和实验室难以推广。尽管指示细胞培养法能大大缩短分离培养所需时间，但培养过程中菌株容易死亡，亦不适用于临床快速检测。血清学方法在临床上广泛使用，尽管一些商品化试剂盒市面有售，但各试剂盒的包被抗原不同以及临界值设定不同导致各试剂盒的特异性和敏感性存在差异。此外，血样的采集时间和患者年龄对依赖血清学方法的实验室诊断影响较大，而某些支原体在血清学上又存在交叉反应性。PCR的出现虽克服了传统实验敏感度低的弊端，但需要特殊仪器，不以普及，亦不适用于基层单位、现场监测和床旁检测。因此，开发一种针对Mp的即时检验方法成为了临床和实验室中亟待解决的问题。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种新型等温核酸扩增技术，它具有简便、快速、经济、灵敏等优点，近年来发展迅速，已被广泛应用于核酸快速检测领域。LAMP的原理是针对靶基因上6个区域设计2对引物(FIP[F1c+F2]、BIP[B2+B1c]、F3、B3)，在链置换型DNA聚合酶的作用下，于等温条件在短时间内(15～60min)进行核酸扩增。在DNA扩增反应中，当一个dNTP分子结合到DNA链上时会解离下一个焦磷酸根离子，后者与镁离子结合形成大量副产物焦磷酸镁，反应结果无需电泳检测，肉眼可见白色沉淀，加入荧光染料后可观察到绿色荧光。与传统PCR相比，LAMP具有操作简便、灵敏度高、特异性强，判定简单，成本低廉等特点。其检测灵敏度至少高于普通PCR 2个数量级。此外，等温扩增仅需一个水浴锅或恒温装置，对设备的要求简单，其操作过程耗时较短，可在1小时内完成。LAMP反应结果的检测不需要像普通PCR进行凝胶电泳，只需通过肉眼观察白色浑浊或者绿色荧光即可，是一种简便、快捷、高通量的检测方法。

LAMP在国内外已有报道其在肺炎支原体检测方面的应用，但是迄今为止，市场上还未见用于检测Mp的LAMP专用引物与试剂盒问世。因此开发一种针对Mp的快速可靠的核酸检测方法具有重要意义。

发明内容

本发明的主要内容是提供一种用于检测Mp的LAMP检测专用引物、检测方法及试剂盒，该法不依赖于DNA提纯过程，粗提模板亦可进行等温扩增，尤其适用于各基层单位及现场监测。

1.Mp的LAMP检测专用引物

引物设计靶点为Mycoplasma pneumonia M129chromosome，complete genome，NCBI reference sequence NC_000912.1应用在线引物设计软件PrimerExplorerV5，上传靶序列后，即可初步得到多组引物序列。