[发明专利]一种检测大气颗粒物致眼损伤的方法

说明书

技术领域

本发明属于医疗卫生及生物技术领域，具体为一种检测大气颗粒物致眼 损伤的方法。

背景技术

空气污染已成为世界许多地区一个重要的公共卫生问题。越来越多的流 行病学和临床证据表明，污染物使人群各种疾病的患病率增加。大气颗粒物 (particular matter，PM)是不同大小和化学特征的液体和固体材料的混 合物，包括释放到空气中的烟尘、烟雾、灰尘、污垢等。颗粒物依据其动力 学直径，将空气动力学直径≤2.5μm的固体颗粒物称为PM_2.5，PM_2.5是各种 气体的混合物和颗粒组件，主要由含碳物质、有机质、元素碳的总和、有机 物组成。目前认为PM_2.5主要是人为燃烧排放等过程而产生，是雾霾的主要成 分，可能对人体健康产生负面影响，因此对于PM_2.5的监测和研究极为重要。 眼球作为机体的一个重要器官，眼表直接暴露于外界，颗粒物PM_2.5是否对眼 表产生影响？目前，大部分的研究都是对于肺部、鼻部，而对于眼镜，还没 有建立良好的、能够标准化、规模化，易于推向市场的检测方法。

发明内容

为解决上诉技术问题，本发明提供了一种能够检测出大气颗粒物对眼睛 是否有影响的方法，方便、快捷，可为临床防治提供理论基础。

为了实现上述目的，本发明公开的技术方案为：本发明公开的检测 大气颗粒物致眼损伤的方法，包括如下步骤，(1)采用四通道大气颗粒 物智能采样仪，切割出大气颗粒物，采用聚四氟乙烯滤膜包覆大气颗粒 物，将包覆有滤膜的大气颗粒物浸入蒸馏水中，超声振荡后用纱布滤过， 干燥后备用；

(2)取步骤(1)备用的大气颗粒物，将大气颗粒物稀释于无菌的 PBS中得到大气颗粒物滴眼液，再向大气颗粒物加入苯扎溴铵，保存于4℃ 冰箱备用；

(3)取体外眼角膜组织细胞，向体外培养角膜组织细胞滴入步骤(2) 配置出的滴眼液设置成试验组，并设置空白对照组，将试验组和空白对 照组采用荧光素染色、苏木精、伊红染色后，观察体外培养角膜组织细 胞损伤情况。

最贴合现实的模拟自然环境，采用最贴合人体眼睛环境的体外培养角膜 组织细胞为试验对象，最大化与实际情况相符，采用四氟乙烯滤膜包覆大气 颗粒物、与PBS溶解、加入苯扎溴铵可以很容易的均匀分散，更容易的形成 匀质的滴眼液，有助于后续滴加进体外培养角膜组织细胞中，使实验组、空 白对照组均匀度一致，无其他菌落，去除影响检测的干扰。

进一步的，所述步骤(3)中使用浓度为10g·L-1荧光素钠溶液分别滴 入1μl至试验组和空白对照组的体外培养角膜组织细胞中，使荧光素钠溶 液均匀分布于体外培养角膜组织细胞表面，在裂隙灯显微镜钴蓝光下观察记 录角膜染色区出现的破裂情况。荧光素钠本身没有对体外培养角膜组织细胞 有损伤作用，采用它对体外培养角膜组织细胞染色，可以良好的观察出体外 眼角膜组织细胞的损伤情况。

进一步的，所述步骤(3)中分别将试验组、空白对照组的体外培养角 膜组织细胞用质量浓度为4％多聚甲醛溶液固定，然后经石蜡包埋、切片处理， 采用苏木精-伊红染色，置入显微镜下观察角膜损伤情况。所述固定是制作 标本常用的方法，即就是向材料体内注射部分固定夜，再浸渍固定液，本发 明选用4％多聚甲醛溶液作为固定液，可快速杀死细胞，使细胞最大化保持原 有自然状态、不皱缩、不膨胀，同时，一方面使组织硬化便于截切，而且增 加内含物折光度，使某些体外眼角膜组织细胞便于着色、观察。

进一步的，该方法还包括步骤(4)，将试验组、空白对照组的体外培养 角膜组织细胞分别经质量浓度为2.5％戊二醛溶液前固定2小时，质量浓度为 1％锇酸溶液后固定1小时，再分别经真空冷冻干燥、乙醇梯度脱水，包埋， 经枸橼酸铅和醋酸双氧铀双重染色后于场发射扫描电子显微镜和透射电子 显微镜下观察角膜上皮细胞超微结构。采用所述方法对体外培养角膜组织细 胞进一步观察，可从多方面、多角度，更综合、真实的检测出大气颗粒物对 体外培养角膜组织细胞的损伤情况。

进一步的，所述步骤(1)中对大气颗粒物切割的粒径为2.5-10μm，将 包覆有大气颗粒物的四氟乙烯滤膜裁剪为1cm×1cm，超声振荡45min，经真 空条件下冷冻干燥，再于4℃保存备用。所切割的粒径为自然环境条件下最 常见的颗粒物，经振荡后，使颗粒物更好的与四氟乙烯滤膜相包覆。