[发明专利]一种荧光探针及其合成方法和在循环肿瘤细胞检测中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物化学检测技术领域，更具体地说，涉及一种以组织蛋白酶B为靶点的荧光探针及其合成方法和在肿瘤检测中的应用。

背景技术

肿瘤是全球首位的致死性疾病，其发病率和死亡率一直居于各疾病前列，且近年来有快速增长的趋势。由于肿瘤发病比较隐匿，在患者有临床症状时一般都已发生转移，据统计超过90％的肿瘤患者死于肿瘤转移。

外周血肿瘤细胞数量极少，且存在大量正常细胞的干扰，检测较困难。目前常用的检测技术主要有常规的细胞学染色检测、免疫细胞化学技术。这类方法大多通过对外周血、腹腔或肿瘤区域的肿瘤细胞进行收集、离心，并采用等常规的苏木精-伊红染色法进行游离肿瘤细胞的检测，过程繁杂，阳性率很低。近些年发展起来的新型的诊断技术有流式细胞检测技术、聚合酶链反应(PCR)、逆转录-聚合酶链反应、免疫磁珠及基于肿瘤体积及形变能力而设计的滤膜过滤法及微流控检测技术。基于PCR的检测方法优势是灵敏度极高，能检测到数个甚至单个的肿瘤细胞。然而肿瘤细胞很难找到非常特异性的mRNA标志物，一些正常细胞也会有极低的肿瘤标志物基因的表达，高灵敏度的PCR时常将这些本底表达扩大，导致假阳性的结果。而常规染色剂免疫组化操作过程繁琐，灵敏度较低，且肿瘤细胞在操作过程中容易丢失，引起假阴性等问题。

最近几年随着材料和工程学的发展，基于微流控的细胞检测技术有很大的发展，已出现较多新颖且便捷的检测技术及装置。微流控技术在肿瘤检测方面有灵敏、便捷和样本量少的优势，但这些方法还是基于常规PCR或者免疫荧光法，对肿瘤标志基因或肿瘤抗原有很大的依赖，且检测过程需要多个洗脱步骤，导致肿瘤细胞的丢失，因此准确性及可靠度仍需进一步验证。

上述几种检测方法均依赖实验室人工操作，人为因素影响较大，因此自动化或半自动化的诊断仪器更适合医院等单位使用。目前国际上最通用的自动化检测设备是美国强生公司推出的基于免疫磁珠分离的循环肿瘤细胞检测与分析系统(CellSearch System)。该设备也是国际首台获得美国食品药品管理局(FDA)认证且被大量临床研究证实其有效性及可靠性的设备。检测时利用癌细胞通用标志物及血细胞通用标志物对血液中的肿瘤细胞进行正向和负向的分选，再对得到的细胞上特异性的肿瘤蛋白标记物进行标记和染色，最后通过半自动显微镜扫描计数。该方法的优势是检测能实现半自动化，灵敏度高，但其检测费用昂贵，单次收费5000-8000元人民币，给患者带来较大的经济负担。

总体而言，目前国内外临床上使用的CTC诊断方法均须以下几步：1.对外周血进行分离和富集；2.提取核酸进行扩增或对肿瘤抗原进行标记；3.电泳、测序检测DNA或显微镜观察计数。这这些方法均涉及多个洗脱和回收步骤，肿瘤细胞的丢失现象普遍存在，人工操作过程的增加也导致检测误差因素的增多，而且很多肿瘤细胞并不表达或者低表达一些常规标志分子，因此也在很大程度上影响CTC的检出率。最重要的一点是这些技术均难以与现有检测设备结合实现CTC诊断的全自动化，不利于检测稳定性和准确性的提高。

有鉴于此，确有必要提供一种灵敏度高、操作简便快捷、成本较低的肿瘤细胞检测方法。

发明内容

本发明的目的在于：克服现有肿瘤细胞检测中存在的成本高、操作复杂、准确性较差等问题，提供一种灵敏度高、操作简便快捷、成本较低的荧光探针及其合成方法和应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供一种荧光探针，其包括荧光基团、组织蛋白酶B的底物和叶酸分子，荧光基团与组织蛋白酶B的底物通过自降解键连接，再与叶酸分子连接；荧光基团在游离状态能被激发光激发，与其它分子共价连接后淬灭。因量子产率很低，所以该荧光探针在底物保护状态下很难被激发光激发，在底物保护下不能发出荧光或只发射极弱荧光。

作为本发明荧光探针的一种改进，所述组织蛋白酶B的底物为苯丙氨酸-赖氨酸。

作为本发明荧光探针的一种改进，所述自降解键由至少两个骨架单元首尾连接形成(一个骨架单元的氨基与下一个骨架单元的羟基连接)，骨架单元由氨基苯甲醇、氨基苯二甲醇和氨基苯三甲醇连接组成。

作为本发明荧光探针的一种改进，一个组织蛋白酶B的底物可结合若干个荧光基团，当组织蛋白酶B的底物结合一个荧光基团时，为单倍荧光探针；当结合两个荧光基团时，为2倍放大荧光探针，以此类推。荧光探针的倍数越高，其检测灵敏度也越高。

为了实现上述发明目的，本发明还提供上述荧光探针的合成方法，包括如下步骤：

(1)以苄氧羰基保护的苯丙氨酸酯与二碳酸二叔丁酯(PG1)保护的赖氨酸反应，得到赖氨酰苯丙氨酸酯；