[发明专利]一种人多能干细胞来源人视网膜色素上皮细胞的制备和扩增培养方法

权利要求书

1.一种人多能干细胞来源人视网膜色素上皮细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：收集人多能干细胞来源的3D-RPE球体，机械分离、去除不含色素的非RPE细胞或团块，留取含有色素的RPE细胞片，酶解消化含有色素的RPE细胞片，获得RPE单细胞悬液，由此获得人多能干细胞来源人视网膜色素上皮细胞。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的3D-RPE球体是将人多能干细胞定向诱导分化为包括RPE细胞的视网膜细胞，随后将贴壁细胞包括RPE细胞刮起，进行悬浮培养，获得3D-RPE球体，3D-RPE球体是游离的，粘附于神经视网膜杯的一侧或粘附于其他细胞团的一侧。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的机械分离、去除不含色素的非RPE细胞或团块，留取含有色素的RPE细胞片具体为：将所有3D-RPE球体转移到细胞容器内，用消化液于37℃水浴下消化8-15min，吸除消化液，1×PBS洗若干次后，使用钨丝针将含有色素的RPE细胞片与无色素的非RPE细胞或团块分离，留取含有色素的RPE细胞片。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的酶解消化含有色素的RPE细胞片，获得RPE单细胞悬液，其步骤具体为：将含有色素的RPE细胞片，用TrypLE Express溶液，37℃水浴消化7-10min，终止消化，70-100μm滤网过滤细胞，离心去消化液，用RPE细胞培养基重悬，获得RPE单细胞悬液。

5.一种人多能干细胞来源人视网膜色素上皮细胞的扩增培养方法，其特征在于，将权利要求1的RPE单细胞悬液离心后弃上清再用RPE细胞培养基重悬，接种到预先包被了细胞外基质的细胞培养容器中进行原代培养，细胞长满后进行传代培养，获得人多能干细胞来源人视网膜色素上皮细胞。

6.根据权利要求5所述的扩增培养方法，其特征在于，所述的原代培养接种的细胞密度大于等于5×10⁴个细胞/cm²。

7.根据权利要求5所述的扩增培养方法，其特征在于，所述的细胞长满后进行传代培养具体为：当原代培养的细胞融合度达到90-100％时，弃培养基，PBS洗涤，用TrypLEExpress，37℃培养箱内消化7-10min，用RPE细胞培养基终止消化，用移液枪轻轻吹下细胞，离心去除消化液，用RPE细胞培养基重悬细胞，接种细胞到预先包被了细胞外基质的细胞培养容器内，进行传代培养；当细胞融合度达到90-100％时，重复上述步骤进行反复传代培养；所述的传代培养接种的细胞密度大于等于2×10⁴个细胞/cm²。

8.根据权利要求5所述的扩增培养方法，其特征在于，所述的细胞外基质为Matrigel或Gelatin。

9.根据权利要求5所述的扩增培养方法，其特征在于，所述的原代培养和传代培养的RPE细胞培养基的配方均为：每100mL细胞培养基含有10mL胎牛血清、2mL 50×B27神经细胞生长添加剂、1mL 100×青链霉素混合液、1mL 100×非必需氨基酸、1mL 100×谷氨酰胺和0.1mL 1000×牛磺酸，余量为DMEM/F12混合培养基，所述的DMEM/F12混合培养基是由DMEM/F12(1:1)培养基和DMEM培养基按照体积比为3:2混合而成。