[发明专利]一种人多能干细胞来源人视网膜色素上皮细胞的制备和扩增培养方法

说明书

本发明公开了人多能干细胞来源人视网膜色素上皮细胞的制备和扩增培养方法。它包括以下步骤：收集人多能干细胞来源的3D‑RPE球体，机械分离、去除不含色素的非RPE细胞或团块，留取含有色素的RPE细胞片；酶解消化含有色素的RPE细胞片，获得RPE单细胞悬液，由此获得人多能干细胞来源人视网膜色素上皮细胞。本发明方法制备的人RPE细胞的特性与人胚胎来源RPE细胞特性极其类似，具有典型RPE细胞形态特征，并呈现正常生理功能。本发明方法制备的人RPE细胞可传代培养，大量扩增，为视网膜疾病的研究和治疗提供种子细胞，造福失明患者，解决了现有人视网膜色素上皮细胞来源有限，RPE移植供体缺乏的重要缺陷，具有重大意义。

技术领域：

本发明属于干细胞技术领域，具体涉及一种人多能干细胞来源人视网膜色素上皮细胞的制备和扩增培养方法。

背景技术：

视网膜色素上皮(RPE,retinal pigment epithelium)位于视网膜神经上皮层外侧，为后者提供营养并参与光转导反应。其变性死亡或功能异常是视网膜变性眼病的重要原因。视网膜色素上皮细胞移植是最有前景的复明手段之一，但RPE细胞缺乏制约了该治疗措施的开展。干细胞技术兴起之前，RPE细胞来源局限于从早期流产胚胎或自愿者捐赠的眼球分离获得。最近研究表明，人多能干细胞(human pluripotent stem cell,hPSC)，包括人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESC)和人诱导多能干细胞(human inducedpluripotent stem cell,hiPSC)，具有向视网膜色素上皮细胞分化的能力。hPSCs诱导来源的RPE细胞是治疗视网膜变性疾病最有发展前景的种子细胞。多能干细胞分化为RPE细胞的诱导方法大体分为两类，2D传统贴壁培养法和3D视网膜诱导分化法。然而，这些方法获得的RPE通常与hPSC分化过程中产生的非RPE细胞混杂在一起。因此，如何将其中的RPE细胞分离纯化，获取RPE种子细胞，供相关研究或治疗使用，是目前需要解决的技术难题。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种简单、适用范围广的人多能干细胞来源人视网膜色素上皮细胞的制备和扩增培养方法。

本发明的一种人多能干细胞来源人视网膜色素上皮细胞的制备方法，包括以下步骤：收集人多能干细胞来源的3D-RPE球体，机械分离、去除不含色素的非RPE细胞或团块，留取含有色素的RPE细胞片，酶解消化含有色素的RPE细胞片，获得RPE单细胞悬液，由此获得人多能干细胞来源人视网膜色素上皮细胞。

本发明方法制备的多能干细胞来源RPE细胞的特性与人胚胎来源RPE细胞特性极其类似，具有典型RPE细胞形态特征，表达特异分子标签PAX6，OTX2，ZO-1和RPE65，并呈现正常生理功能如极性分泌细胞因子PEDF。

所述的人多能干细胞优选为人胚胎干细胞或人诱导多能干细胞。这两种细胞用公知的方法进行细胞培养。

所述的3D-RPE球体是人多能干细胞定向诱导分化为含有RPE细胞的视网膜细胞，随后将贴壁细胞包括RPE细胞刮起，进行悬浮培养，获得3D-RPE球体。3D-RPE球体可以是游离的，也可以粘附于神经视网膜杯的一侧，或粘附于其他细胞团的一侧。

所述的3D-RPE球体优选为人多能干细胞诱导分化40天以上的3D-RPE球体。hPSC启动分化(即hPSC的扩增培养液更换为分化培养液或制备拟胚体)的当天设置为分化的第“0”天。

所述的机械分离、去除不含色素的非RPE细胞或团块，留取含有色素的RPE细胞片具体为：将所有3D-RPE球体转移到细胞容器内，用消化液于37℃水浴下消化8-15min，吸除消化液，1×PBS洗若干次后，使用钨丝针将含有色素的RPE细胞片与无色素的非RPE细胞或团块分离，留取含有色素的RPE细胞片。

所述的消化液优选为质量分数1-2％的Dispase II溶液。