[发明专利]用于怀牛膝根系基因组DNA甲基化分析的DNA提取方法

权利要求书

1.一种用于怀牛膝根系基因组DNA甲基化分析的DNA提取方法，包括如下步骤：

（1）取新鲜根系样品0.5～1g放入研钵中，迅速加入液氮，研磨充分后，移入离心管中，加入1.6～2.0ml的4%的CTAB提取液后，再加入60µl的β-巯基乙醇后，盖紧离心管，轻弹并震荡匀浆后，放入65℃水浴锅中加热0.5～1.5小时，在此期间，每隔3～6分钟轻微颠倒1次，加热之后在25～35℃下10000～15000 rpm转离心15～20分钟；

所述CTAB提取液含4% 的CTAB、100nmol/L的Tris-HCl、20mmol/L、pH=8的EDTA、2 mol/L的NaCl、5% 的PVP、1%的SDS；

（2）吸取上步所得上清液，移入另一离心管中，并按上清液体积的1/3加入抽提液，轻轻上下颠倒混匀后，室温静置4～6分钟，在25～35℃下，10000～15000rpm转速离心8～12分钟；重复该步骤1～2次；

（3）吸取上步所得上清液，移入另一新的离心管中，并按该上清液体积的1/4加入氯仿，轻轻上下颠倒混匀后，室温静置4～6分钟，在25～35℃下10000～15000rpm转速离心8～12分钟；

（4）吸取上步所得上清液450～550 µl，移入另一新的离心管中，加入0.8～1.2ml -20℃下预冷的无水乙醇，轻轻上下颠倒混匀后，于-20℃下沉淀30～60分钟后，在4℃下10000～15000 rpm离心15～20分钟，去除上层溶液，得沉淀DNA；

（5）向步骤（4）所得沉淀DNA中加入450～550µl的高盐溶液，65℃的水浴锅中孵育25～35分钟，4℃下10000～15000rpm转速离心8～12分钟；重复步骤（2）至步骤（4）；

（6）加入0.8～1.2ml的75%乙醇，轻轻颠倒混匀洗涤DNA，在4℃下10000～15000rpm转离心4～6分钟；重复洗涤3～4次后，再用0.8～1.2 ml无水乙醇的洗涤1次后，将离心管平放在滤纸上晾干，加入30µl无菌的ddH₂O溶解DNA；

（7）加入1ul的 RNase 后，在37℃的水浴锅中孵育2小时，放入-80℃冰箱备用。

2.根据权利要求1所述的用于怀牛膝根系基因组DNA甲基化分析的DNA提取方法，其特征在于，在所述步骤（1）中，所述CTAB提取液在使用前先放入65℃的水浴锅中预热15～25分钟。

3.根据权利要求1所述的用于怀牛膝根系基因组DNA甲基化分析的DNA提取方法，其特征在于，在所述步骤（2）中，所述抽提液是氯仿与异戊醇按24：1的体积比的混合液。

4.根据权利要求1所述的用于怀牛膝根系基因组DNA甲基化分析的DNA提取方法，其特征在于，在所述步骤（5）中，所述高盐溶液含1.5 mol/L 的NaCl、100mmol/L的pH=8的Tris-HCl、20mmol/L 的pH=8的EDTA。