[发明专利]用于怀牛膝根系基因组DNA甲基化分析的DNA提取方法

说明书

本发明涉及一种用于怀牛膝根系基因组DNA甲基化分析的DNA提取方法。本发明基于CTAB法主要进行以下改进，CTAB、PVP、NaCl的浓度分别提高至4%、5%、2mol/L，同时添加1%SDS，并以氯仿与异戊醇混合液为抽提液，且裂解和抽提步骤的离心温度控制为25～35℃，再以无水乙醇沉淀DNA，并加高盐溶液离析多糖等杂质，再次沉淀DNA。本发明方法提取的怀牛膝根系DNA纯度高，酶切完全，甲基化基因筛选的多态性高、重复性好，提取获得的DNA可有效地应用于怀牛膝根系基因组DNA甲基化分析，为从表观遗观学水平研究怀牛膝生长发育、逆境胁迫、药效成分的积累等过程中的分子调控机制奠定物质基础。

技术领域

本发明属于表观遗传学领域，具体涉及一种用于怀牛膝根系基因组DNA甲基化分析的DNA提取方法。

背景技术

基因组DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶（DNMTs）的催化下，DNA序列中的富含CpG两个核苷酸区域的胞嘧啶被选择性地加上一个甲基，形成5-甲基胞嘧啶，促使DNA在碱基序列不变的情况下，被甲基化的DNA区域结构发性改变，相应地抑制了该区域基因序列的正常转录而调控基因表达。

DNA甲基化是真核生物细胞在表达观遗传水平上DNA修饰的主要方式之一，它在真核生物的基因表达、细胞分化、基因组印记等重要的生物学过程起关键调控作用。DNA提取的质量是研究真核生物细胞基因组DNA甲基化修饰的调控机制关键，直接影响着下游实验的准确性、精确性和重复性。

目前，在研究基因组DNA甲基化的技术中，基于PCR方法的应用最为广泛，主要有甲基化敏感扩增多态性(Methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP)、重亚硫酸盐测序法（Bisulphite sequencing，BSP）、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析（MS-HRM）等。经典的MSAP是利用对基因组DNA甲基化敏感性不同的两种限制性内切酶HpaII和MspI对5'-CCGG位点甲基化进行特异性切割，根据该位点胞嘧啶甲基化的敏感性不同，能够很好地反映基因组DNA 5'-CCGG位点胞嘧啶的甲基化状态和程度，该方法经济实用、灵敏度高，可分析出DNA甲基化或去甲基化区域的等位基因是否存在，该方法对DNA质量的纯度要求较高，低质量的DNA可使其酶切完全，严重降低了实验的重复性。BSP和甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析均是利用重亚硫酸盐处理DNA模板可使胞嘧啶转化为尿嘧啶，而被甲基化的胞嘧啶保持不变，在此处理过程中，低质量的DNA，不完全的亚硫酸氢盐转化会导致假阳性结果。实验材料DNA的提取是研究DNA甲基化的第一步，也是非常关键的步骤，DNA质量的好坏，直接影响着下游实验的准确性、精确性和重复性。

目前报道的多种DNA提取法中，SDS方法和CTAB方法适用最为广泛。但由于不同的植物材料中的各种成分含量存在较大的差异，根据不同植物不同组织的特点，选择最适合的提取方法十分重要。怀牛膝根系由于含有大量的多糖、蛋白、次生代谢中的酚类和酮类等物质。SDS方法的特点在于去除蛋白的能力较其它提取方法优越，而对于多糖、次生代谢的物质去除效果无CTAB方法明显。因此，开发一种适合基因组DNA甲基化分析的怀牛膝根系DNA提取方法尤其重要，为今后利用基因组DNA甲基化修饰技术分析怀牛膝根系基因表达调控的表观遗传学研究研究提供技术支撑。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何提供一种用于怀牛膝根系基因组DNA甲基化分析的DNA提取方法，该方法提取的纯度高、产率高，能为今后利用基因组DNA甲基化分析技术研究怀牛膝在不同环境下、不同组织、不同发育时期的DNA甲基化修饰状态的变化及其基因表达的调控机制等方面的研究奠定理论基础和物质基础。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

设计一种用于怀牛膝根系基因组DNA甲基化分析的DNA提取方法，包括如下步骤：